透镜组前面还装有孔径光栏，它可以开大和缩小，影响着成像的分辨力和反差 若将孔径光栏开放过大，超过物镜的数值孔径时，便产生光斑：若收拢孔径光栏 过小，分辨力下降，反差增大。因此，在观察时，通过孔径光栏的调节再把视场 光栏（具备视场光栏的显微镜）开启到视场周缘的外切处，使不在物视场内的物 体得不到任何光线的照明，以避免散射光的干扰。 (3)物镜安装在镜筒前端物镜转换器上的透镜。利用光线使被检物体第 一次造像，因而直接关系和影响着成像的质量，对分辨力有着决定性的影响。物 镜的性能可以从物镜外壳上标志着的数值孔径(numerical apeature,简写为NA) 大小来表示。NA是指物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率()和镜口角 (u)半数的正弦之乘积，可用公式表示： NA=n-sin u/2 数值孔径的大小又是衡量一台显微镜分辨力强弱的依据。分辨力是指显微镜 能辨别物体两点之间最小距离的能力。用8表示，其公式如下：6=1/NA 从公式中可看出，NA愈大，或观察时所用光波愈短，则分辨力愈大。提高 分辨力有下述措施： ①选择波长较短的光源，在使用可见光（如卤素灯或钨丝灯）作光源时，可 加蓝色滤光片以吸收长波的红、橙光，使波长接近于平均波长(0.55μm)。如果 使用波长为0.27μm的紫外光为光源，其分辨力可提高2倍。 ②增大介质的折射率。空气折射率为1.0，水折射率为1.33，玻璃折射率为 1.52,香柏油折射率为1.51。所以在观察细菌形态时，都使用油浸物镜，目的是 利用香柏油与玻璃的折射率近似的特性，以减少光线从一介质进入另一介质时产 生折射而散失，可增强视野的亮度和提高分辨力。 ③增大物镜的镜口角，但其极限值最大也难达到180°，改良余地很小。 ④增加明暗反差，使标本的明暗对比增强，这也是提高清晰度的一项措施。 另外，物镜的种类很多，可从不同角度来分类：根据物镜前透镜与被检物体 之间的介质不同，可分为： ①干燥系物镜以空气为介质，如常用的40×以下的物镜，数值孔径均小 于1。 ②油浸系物镜常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜，其放大率为90× 100×,数值孔径值大于1。 根据物镜放大率的高低，可分为： ①低倍物镜指1X一6×，NA值为0.04一0.15： ②中倍物镜指6×一25×，NA值为0.15一0.40： ③高倍物镜指25×一63×，NA值为0.35一0.95：
透镜组前面还装有孔径光栏，它可以开大和缩小，影响着成像的分辨力和反差， 若将孔径光栏开放过大，超过物镜的数值孔径时，便产生光斑；若收拢孔径光栏 过小，分辨力下降，反差增大。因此，在观察时，通过孔径光栏的调节再把视场 光栏（具备视场光栏的显微镜）开启到视场周缘的外切处，使不在物视场内的物 体得不到任何光线的照明，以避免散射光的干扰。 （3）物镜 安装在镜筒前端物镜转换器上的透镜。利用光线使被检物体第 一次造像，因而直接关系和影响着成像的质量，对分辨力有着决定性的影响。物 镜的性能可以从物镜外壳上标志着的数值孔径（numerical apeature，简写为 NA） 大小来表示。NA 是指物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（η）和镜口角 （u）半数的正弦之乘积，可用公式表示： NA = sin u / 2 数值孔径的大小又是衡量—台显微镜分辨力强弱的依据。分辨力是指显微镜 能辨别物体两点之间最小距离的能力。用δ表示，其公式如下： = / NA 从公式中可看出，NA 愈大，或观察时所用光波愈短，则分辨力愈大。提高 分辨力有下述措施： ①选择波长较短的光源，在使用可见光（如卤素灯或钨丝灯）作光源时，可 加蓝色滤光片以吸收长波的红、橙光，使波长接近于平均波长（0.55μm）。如果 使用波长为 0.27μm 的紫外光为光源，其分辨力可提高 2 倍。 ②增大介质的折射率。空气折射率为 1.0，水折射率为 1.33，玻璃折射率为 1.52，香柏油折射率为 1.51。所以在观察细菌形态时，都使用油浸物镜，目的是 利用香柏油与玻璃的折射率近似的特性，以减少光线从一介质进入另一介质时产 生折射而散失，可增强视野的亮度和提高分辨力。 ③增大物镜的镜口角，但其极限值最大也难达到 180o，改良余地很小。 ④增加明暗反差，使标本的明暗对比增强，这也是提高清晰度的一项措施。 另外，物镜的种类很多，可从不同角度来分类：根据物镜前透镜与被检物体 之间的介质不同，可分为： ①干燥系物镜 以空气为介质，如常用的 40×以下的物镜，数值孔径均小 于 l。 ②油浸系物镜 常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜，其放大率为 90×— 100× ，数值孔径值大于 1。 根据物镜放大率的高低，可分为： ①低倍物镜 指 l× — 6×，NA 值为 0.04 — 0.15； ②中倍物镜 指 6× — 25×， NA 值为 0.15 — 0.40； ③高倍物镜 指 25× — 63×，NA 值为 0.35 — 0.95；
④油浸物镜指90×一100×，NA值为1.25一1.40. 根据物镜像差校正的程度来分类可分为： ①消色差物镜是最常用的物镜，外壳上标有“Ach”字样，主要可以校正 轴上点的位置色差（红、蓝二色）和球差（青光）以及近轴点慧差。镜检时通常 与惠更斯目镜配合使用。 ②复消色差物镜物镜外壳上标有“Apo”字样。除能校正红、蓝、绿三色 光的色差外，还能校正黄色光造成的相差。通常与补偿目镜配合使用。 ③特种物镜在上述物镜基础上，为达到某些特定观察效果而制造的物镜。 如：带校正环物镜：带虹彩光栏物镜：相衬物镜：荧光物镜：无应变物镜：无罩 物镜：长工作距离物镜等。目前在研究中常用的物镜还有：半复消色差物镜(FL), 平场物镜(Plan),平场复消色差物镜(Plan Apo),超平场物镜(Splan),超平 场复消色差物镜(Splan Apo)等。 (4)目镜目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次，并把物像映入 观察者的眼中。目镜的结构较物镜简单，普通光学显微镜的目镜通常由两个透镜 组成，上端的一块透镜称“接目镜”，下端的透镜称“场镜”。上下透镜之间或在 两个透镜的下方，装有由金属制的环状光栏或叫“视场光栏”，物镜放大后的中 间像就落在视场光栏平面处，所以其上可安置目镜测微尺。 普通光学显微镜常用的目镜为惠更斯目镜(Huygens eyepiece),如果要进 行研究用时，一般选用性能更好的目镜，如补偿目镜(K)、平场目镜(P)、广 视场目镜(WF)。照相时选用照相目镜(NFK)。 (二)光学显微镜的成像原理 显微镜的放大是通过透镜来完成的，单透镜成像具有像差，影响像质。因此 由透镜组组合起来相当于一个凸透镜， 起到放大的作用，图3是显微镜的成像 原理模式。AB为标本一一物镜L0 目镜Le一一眼睛。A"B"和眼点的距离 为显微镜的明视距离，它的成像原理 是：标本AB的像经过L0(物镜)后 到AB处成为一个放大倒立的实像（中 间像)，F为L0的后焦点。当光线传递 到Le(目镜)时，AB的实像在AB 目镜 处被放大成一个直立（相对中间像而 图3显徽镜的成像原理模式图 言)的虚像，然后传递到视网膜AB 上，标本AB就被放大了，人眼看到的AB被放大后的虚像AB'与原样品像的方
④油浸物镜 指 90× — 100×， NA 值为 1.25 — 1.40。 根据物镜像差校正的程度来分类可分为： ①消色差物镜 是最常用的物镜，外壳上标有“Ach”字样，主要可以校正 轴上点的位置色差（红、蓝二色）和球差（青光）以及近轴点慧差。镜检时通常 与惠更斯目镜配合使用。 ②复消色差物镜 物镜外壳上标有“Apo”字样。除能校正红、蓝、绿三色 光的色差外，还能校正黄色光造成的相差。通常与补偿目镜配合使用。 ③特种物镜 在上述物镜基础上，为达到某些特定观察效果而制造的物镜。 如：带校正环物镜；带虹彩光栏物镜；相衬物镜；荧光物镜；无应变物镜；无罩 物镜；长工作距离物镜等。目前在研究中常用的物镜还有：半复消色差物镜（FL）， 平场物镜（Plan），平场复消色差物镜（Plan Apo），超平场物镜（Splan），超平 场复消色差物镜（Splan Apo）等。 （4）目镜 目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次，并把物像映入 观察者的眼中。目镜的结构较物镜简单，普通光学显微镜的目镜通常由两个透镜 组成，上端的一块透镜称“接目镜”，下端的透镜称“场镜”。上下透镜之间或在 两个透镜的下方，装有由金属制的环状光栏或叫“视场光栏”，物镜放大后的中 间像就落在视场光栏平面处，所以其上可安置目镜测微尺。 普通光学显微镜常用的目镜为惠更斯目镜（Huygens eyepiece），如果要进 行研究用时，一般选用性能更好的目镜，如补偿目镜（K）、平场目镜（P）、广 视场目镜（WF）。照相时选用照相目镜（NFK）。 （二）光学显微镜的成像原理 显微镜的放大是通过透镜来完成的，单透镜成像具有像差，影响像质。因此 由透镜组组合起来相当于一个凸透镜， 起到放大的作用。图 3 是显微镜的成像 原理模式。AB 为标本——物镜 Lo—— 目镜 Le——眼睛。A"B"和眼点的距离 为显微镜的明视距离，它的成像原理 是：标本 AB 的像经过 Lo（物镜）后 到 AB 处成为一个放大倒立的实像（中 间像），F 为 Lo 的后焦点。当光线传递 到 Le（目镜）时，AB 的实像在 AB 处被放大成一个直立（相对中间像而 言）的虚像，然后传递到视网膜 AB 上，标本 AB 就被放大了，人眼看到的 AB 被放大后的虚像 A'B'与原样品像的方
向是相反的。 三、显微镜的使用操作及注意事项 显微镜结构精密，使用时必须细心，要按下述操作步骤进行。 (一)观察前的准备 1、显微镜从显微镜柜或木盒内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座， 平稳地将显微镜搬运到实验桌上。 2、将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约10cm左右，右侧可放 记录本或绘图纸。 3、调节亮度插好电源插头，打开显微镜主电源开关，通过亮度调节旋钮 调整照明度，使物像清晰。 4、调节光轴中心显微镜在观察时，其光学系统中的光源、聚光器、物镜 和目镜的光轴及光栏的中心必须跟显微镜的光轴同在一直线上。如具备视场光栏 的显微镜，调节时先将视场光栏缩小，用10×物镜观察，在视场内可见到视场 光栏圆球多边形的轮廓像，如此像不在视场中央，则利用聚光器外侧的两个调整 旋钮将其调至中央，然后缓慢地将视场光栏打开，能看到光束向视场周缘均匀展 开直至视场光栏的轮廓像完全与视场边缘内接，说明光线已经合轴。 (二)低倍镜观察镜检任何标本要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为 低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。 将标本制片放置载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处 在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜降至距标本0、5cm处，用目镜观察并 同时用粗调节旋钮慢慢升起镜筒或下降载物台，直至物像出现，再用细调节旋钮 使物像清晰为止。移动标本，找到合适的目的物并将它移到视野中央，进行观察 或为下步进行高倍镜观察用。 (三)高倍镜观察在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。在正常情况下， 高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片，若使用不同型号的物镜，在转 换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调整光亮适度， 缓慢调节粗调节旋钮，使载物台上升或镜筒下降，直至物像出现，再用细调节旋 钮调至物像清晰为止。找到需观察的部位，并移至视野中心进行观察或准备用油 镜观察用。 (四)油镜观察油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之 间的距离)很短，一般在0.2mm以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有 “弹簧装置”因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标
向是相反的。 三、显微镜的使用操作及注意事项 显微镜结构精密，使用时必须细心，要按下述操作步骤进行。 （一）观察前的准备 1、显微镜从显微镜柜或木盒内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座， 平稳地将显微镜搬运到实验桌上。 2、将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约 10cm 左右，右侧可放 记录本或绘图纸。 3、调节亮度 插好电源插头，打开显微镜主电源开关，通过亮度调节旋钮 调整照明度，使物像清晰。 4、调节光轴中心 显微镜在观察时，其光学系统中的光源、聚光器、物镜 和目镜的光轴及光栏的中心必须跟显微镜的光轴同在一直线上。如具备视场光栏 的显微镜，调节时先将视场光栏缩小，用 10×物镜观察，在视场内可见到视场 光栏圆球多边形的轮廓像，如此像不在视场中央，则利用聚光器外侧的两个调整 旋钮将其调至中央，然后缓慢地将视场光栏打开，能看到光束向视场周缘均匀展 开直至视场光栏的轮廓像完全与视场边缘内接，说明光线已经合轴。 （二）低倍镜观察 镜检任何标本要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为 低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。 将标本制片放置载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处 在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜降至距标本 0、5cm 处，用目镜观察并 同时用粗调节旋钮慢慢升起镜筒或下降载物台，直至物像出现，再用细调节旋钮 使物像清晰为止。移动标本，找到合适的目的物并将它移到视野中央，进行观察 或为下步进行高倍镜观察用。 （三）高倍镜观察 在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。在正常情况下， 高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片，若使用不同型号的物镜，在转 换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调整光亮适度， 缓慢调节粗调节旋钮，使载物台上升或镜筒下降，直至物像出现，再用细调节旋 钮调至物像清晰为止。找到需观察的部位，并移至视野中心进行观察或准备用油 镜观察用。 （四）油镜观察 油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之 间的距离）很短，一般在 0.2mm 以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有 “弹簧装置”因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标
本制片，使物镜也受到损害。必须按下列步骤操作： 1、先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm,再转换油浸物 镜至中央。 2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。 3、从侧面注视，用粗调节旋钮将镜筒缓慢地下降（或上升载物台），使油浸 物镜浸入香柏油中，其镜头几乎与标本接触。 4、从接目镜内观察，放大视场光栏及聚光镜的孔径光栏，上调聚光器，使 光线充分照明。用粗调节旋钮将镜筒徐徐上升（此时绝不能将镜简下降），当出 现物像后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物像， 必须再从侧面观察，重复操作。 5、观察完毕，上升镜筒，转动物镜转换器，使油没物镜偏位，先用擦镜纸 擦去镜头上的油，再用擦镜纸雄少许乙醚酒精混合液（乙醚2份十纯酒精3份） 或二甲苯。擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭干净即可。 6、将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而 是成八字形位置，再下降至最低，降下聚光器，调节亮度旋钮至光线最暗，关闭 主电源开关，拔掉电源线。用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放 回柜内
本制片，使物镜也受到损害。必须按下列步骤操作： 1、先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约 2cm，再转换油浸物 镜至中央。 2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。 3、从侧面注视，用粗调节旋钮将镜筒缓慢地下降（或上升载物台），使油浸 物镜浸入香柏油中，其镜头几乎与标本接触。 4、从接目镜内观察，放大视场光栏及聚光镜的孔径光栏，上调聚光器，使 光线充分照明。用粗调节旋钮将镜筒徐徐上升（此时绝不能将镜筒下降），当出 现物像后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物像， 必须再从侧面观察，重复操作。 5、观察完毕，上升镜筒，转动物镜转换器，使油浸物镜偏位，先用擦镜纸 擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合液（乙醚 2 份十纯酒精 3 份） 或二甲苯。擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭干净即可。 6、将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而 是成八字形位置，再下降至最低，降下聚光器，调节亮度旋钮至光线最暗，关闭 主电源开关，拔掉电源线。用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放 回柜内
实验二 细菌的简单染色 一、目的要求 1、学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握简单染色法和无菌操作技术。 2、巩固显微镜的使用方法。 二、实验原理 细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细猪的细胞小而秀 明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与 背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染 料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它 生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如 美蓝、结品紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能 与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正 电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两 者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 简单染色法即仅用一种染料使细菌着色。此法虽手续简便，但一般只能显示 其形态，不能辨别其构造。 染色前必须先固定细菌。其目的有二，一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上： 二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时应尽量 维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。 三、实验器材 I、菌种大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus awreus)。 2、仪器显微镜。 3、染料草酸铵结晶紫或石炭酸复红。 4、材料载玻片，擦镜纸，二甲苯，香柏油和玻片搁架等 四、操作步骤 1、涂片在洁净无油腻的玻片中央放一小滴蒸馏水、用无菌的接种环挑取 少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜，让其自然晾干。 2、固定手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过微火3次（用手指触涂 片反面，以不烫手为易)。待玻片冷却后，再加染料
实验二 细菌的简单染色 一、目的要求 1、学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握简单染色法和无菌操作技术。 2、巩固显微镜的使用方法。 二、实验原理 细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透 明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与 背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染 料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它 生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如 美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能 与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基 pH 下降时，细菌所带正 电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两 者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 简单染色法即仅用一种染料使细菌着色。此法虽手续简便，但一般只能显示 其形态，不能辨别其构造。 染色前必须先固定细菌。其目的有二，一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上； 二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时应尽量 维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。 三、实验器材 1、菌种 大肠杆菌（Escherichia coli ）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。 2、仪器 显微镜。 3、染料 草酸铵结晶紫或石炭酸复红。 4、材料 载玻片，擦镜纸，二甲苯，香柏油和玻片搁架等。 四、操作步骤 1、涂片 在洁净无油腻的玻片中央放一小滴蒸馏水、用无菌的接种环挑取 少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜，让其自然晾干。 2、固定 手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过微火 3 次（用手指触涂 片反面，以不烫手为易）。待玻片冷却后，再加染料