亮型培慕冠程 令基因工程酋培养 Rare ●)0 88 Usual 89 Figure 13.3. Segregational instability results when a dividing cell donates all Random Distribution its plasmids to one progeny and none (binomial) to the other Sec. 13. 4 Process Constraints: Genetic Instability http://biotech.ecust.educn/jpkc/figc
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc 典型培养过程 ❖基因工程菌培养
亮型培慕冠程 令基因工程酋培养 2、质粒结构不稳定性 除了分离不稳定性问题外,某些细胞保留质粒,但 质粒结构发生改变,而不产生外源蛋白,减少对细 胞的有害影响,这就是结构不稳定性。如果质粒发 生突变,仍保留了抗生素抗性基因,但不合成外源 蛋白,那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养基 中生长。而且由于不合成外源蛋白,生长得比原来 的工程菌更快,使得在这种培养物中带有改变了的 质粒占统治地位的菌,这种培养情况就是结构不稳 定性。 http://biotech.ecust.educn/jpkc/figc
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc 2、质粒结构不稳定性 除了分离不稳定性问题外，某些细胞保留质粒，但 质粒结构发生改变，而不产生外源蛋白，减少对细 胞的有害影响，这就是结构不稳定性。如果质粒发 生突变，仍保留了抗生素抗性基因，但不合成外源 蛋白，那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养基 中生长。而且由于不合成外源蛋白，生长得比原来 的工程菌更快，使得在这种培养物中带有改变了的 质粒占统治地位的菌，这种培养情况就是结构不稳 定性。 典型培养过程 ❖基因工程菌培养
亮型培慕冠程 令基因工程酋培养 3、宿主细胞突变 宿主细胞的突变也会造成生产能力的减少。这些突 变通常改变细胞调节,结果减少目标蛋白的合成。 例如,控制外源蛋白表达的启动子,利用宿主细胞 的启动子,如果宿主细胞启动子的改变,将大大改 变质粒编码蛋白的生产水平。乳糖操纵子是常用是 操纵子,通过加入乳糖或它的结构类似物(如 IPTG)来启动表达,如果乳糖操纵子编码半乳糖 苷透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的结构 类似物进入细胞,从而不能启动细胞的表达 http://biotech.ecust.educn/jpkc/figc
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc 3、宿主细胞突变 宿主细胞的突变也会造成生产能力的减少。这些突 变通常改变细胞调节，结果减少目标蛋白的合成。 例如，控制外源蛋白表达的启动子，利用宿主细胞 的启动子，如果宿主细胞启动子的改变，将大大改 变质粒编码蛋白的生产水平。乳糖操纵子是常用是 操纵子，通过加入乳糖或它的结构类似物（如 IPTG）来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖 苷透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的结构 类似物进入细胞，从而不能启动细胞的表达。 典型培养过程 ❖基因工程菌培养
亮型培慕冠程 令基因工程酋培养 4、生长速率占优势的不稳定性 所有这三种因素的关键是改变了的宿主载体 系统和原宿主载体系统的生长速率不同。 如果改变了的宿主载体系统比原来的宿主 载体系统有生长优势,那么改变了的系统将 最终占优势,基因不稳定性就出现。 表达的诱导 基因工程菌的产物表达需要诱导,诱因主要 有:温度诱导、乳糖或乳糖结构类似物诱导、 氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱导等。 http://biotech.ecust.educn/jpkc/figc
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc 4、生长速率占优势的不稳定性 所有这三种因素的关键是改变了的宿主载体 系统和原宿主-载体系统的生长速率不同。 如果改变了的宿主载体系统比原来的宿主- 载体系统有生长优势，那么改变了的系统将 最终占优势，基因不稳定性就出现。 表达的诱导 基因工程菌的产物表达需要诱导，诱因主要 有：温度诱导、乳糖或乳糖结构类似物诱导、 氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱导等。 典型培养过程 ❖基因工程菌培养
亮型培慕冠程 令基因工程酋培养 五、重组大肠杆菌的高密度培养策邸 关键点:高密度、高表达 菌密度的测定:光密度(OD值或A值)在 波长600~660 菌生长的障碍是 ●重组菌携带外源基因,加重代谢负担,生长缓慢 ●重组蛋白不能分泌到胞外,外源蛋白在菌体内合成 后就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高度疏水 性蛋白对菌体有害,对细胞生长有抑制作用,甚至会 导致细胞中毒或死亡,因此工程菌的比生长速率往往 远小于宿主菌。 http://biotech.ecust.educn/jpkc/figc
http://biotech.ecust.edu.cn/jpkc/fjgc 五、重组大肠杆菌的高密度培养策略 关键点：高密度、高表达 菌密度的测定：光密度（OD值或A值）在 波长600～660 菌生长的障碍是 ⚫重组菌携带外源基因，加重代谢负担，生长缓慢 ⚫重组蛋白不能分泌到胞外，外源蛋白在菌体内合成 后就会造成积累。高表达的外源蛋白尤其是高度疏水 性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作用，甚至会 导致细胞中毒或死亡, 因此工程菌的比生长速率往往 远小于宿主菌。 典型培养过程 ❖基因工程菌培养