第九章微生物的遗传变异遗传和变异是一切生物体最本质的属性之一。所谓遗传，讲的是发生在亲子间即上下代间的关系，即指上一代生物如何将自身的一整套遗传基因稳定地传递给下一代的行为或功能，它具有极其稳定（保守）的特性。（1）遇传型：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因组所携带的遗传信息。遗传型只是一种内在的可能性或潜力，必须在特定的环境下才能体现出来。遗传型（可能性）+环境条件→表型（现实性）（2）表型：指某一生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和，是其遗传型在合适环境条件下通过代谢和发育而得到的具体体现。（3）变异：指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变亦即遗传型的改变。其几率为10-5-10-10。（4）饰变：指外表的修饰性改变，即一种不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。其特点是整个群体中的几乎每一个体都发生同样变化：性状变化的幅度小：因其遗传物质未变，故饰变是不遗传的。微生物成为模式生物的原因是因为它们独特生物学特性：物种与代谢类型的多样性：个体的体制极其简单；营养体一般都是单倍体；易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖；繁殖速度快；易于积累不同的中间代谢物或终产物菌落形态的可见性与多样性；环境条件对微生物群体中各个体作用的直接性和均一性：易于形成营养缺陷型突变株：各种微生物一般都有其相应的病毒：以及存在多种处于进化过程中、富有特色的原姑有性生殖方式等。第一节遗传变异的物质基础一、3个经典转化实验（一）肺炎链球菌转化实验肺炎链球菌有几种不同菌株，有的具荚膜，其菌落表面光滑，故称S型，属致病菌株另一为不形成荚膜、菌落外观租糙，称为R型，是非致病菌株。F.Griffith(1928年)做了以下实验。(1)动物试验加入活R菌或死S菌一→小白鼠（活）加入活S菌一小白鼠（死)小白鼠-(活)加入活R菌和热死S菌直小白鼠（死）抽心血分离+活的S菌(2)细菌培养试验培养血培养热死S菌—一→不生长培养皿养长出R菌--活R菌—肺炎链球菌-热死 S 菌+ 活R菌一培养血培养长出大量 R菌+ 10-‘s 菌1
1 第九章 微生物的遗传变异 遗传和变异是一切生物体最本质的属性之一。所谓遗传，讲的是发生在亲子间即上下 代间的关系，即指上一代生物如何将自身的一整套遗传基因稳定地传递给下一代的行为或功 能，它具有极其稳定(保守)的特性。 （1）遗传型：又称基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因组所携带的 遗传信息。遗传型只是一种内在的可能性或潜力，必须在特定的环境下才能体现出来。 遗传型(可能性) + 环境条件 → 表型(现实性) （2）表型：指某一生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和，是其遗传型在合 适环境条件下通过代谢和发育而得到的具体体现。 （3）变异：指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变， 亦即遗传型的改变。其几率为 10-5 -10-10。 （4）饰变：指外表的修饰性改变，即一种不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转 译水平上的表型变化。其特点是整个群体中的几乎每一个体都发生同样变化；性状变化的幅 度小；因其遗传物质未变，故饰变是不遗传的。 微生物成为模式生物的原因是因为它们独特生物学特性：物种与代谢类型的多样性；个 体的体制极其简单；营养体一般都是单倍体；易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖； 繁殖速度快；易于积累不同的中间代谢物或终产物；菌落形态的可见性与多样性；环境条件 对微生物群体中各个体作用的直接性和均一性；易于形成营养缺陷型突变株；各种微生物一 般都有其相应的病毒；以及存在多种处于进化过程中、富有特色的原姑有性生殖方式等。 第一节 遗传变异的物质基础 一、3 个经典转化实验 （一）肺炎链球菌转化实验 肺炎链球菌有几种不同菌株，有的具荚膜，其菌落表面光滑，故称 S 型，属致病菌株； 另一为不形成荚膜、菌落外观租糙，称为 R 型，是非致病菌株。F.Griffith(1928 年)做了以下 实验。 (1)动物试验 (2)细菌培养试验
(3)S型菌的无细胞抽提液试验培养皿培养活R菌+S菌的尤细胞抽提液长出大量R菌和少量S菌以上实验说明，加热杀死的S型细菌，在其细胞内可能存在一种具有遗传转化能力的物质，它能通过某种方式进入R型细胞，并使R型细菌获得表达S型荚膜性状的遗传特性。1944年0.T.Avery等进行了以下实验：①从活的s菌中抽提各种细胞成分(DNA，蛋白质，荚膜多糖等)。②对各种生化组分进行转化试验①加S菌的DNA长出S菌②加S菌的DNA和DNA酶以外的酶加S茵的DNA和DNA醇活R菌加S菌的RNA?加S菌的蛋白质只长R菌③如S菌的英膜多糖结果表明，只有S型菌株的DNA才能R型菌株转化为S型：而且，DNA纯度越高，其转化效率也越高。（二）噬菌体感染实验把E.coli培养在以放射性32PO4-或35SO42-作为磷源或硫源的组合培养基中，从而制备出含32P-DNA核心的噬菌体或含35S-蛋白质外壳的噬菌体。接着，又作了以下两组实验：从下图两组实验中可清楚地看出，在噬菌体感染过程中，其蛋白质外壳根本未进入宿主细胞。进入宿主细胞的虽只有DNA，但却有自身的增殖、装配能力，最终会产生一大群既有DNA核心、又有蛋白质外壳的完整的子代噬菌体粒。这就有力地证明，在其DNA中，存在着包括合成蛋白质外壳在内的整套遗传信息，上清液中含15%放射性吸附商心10min后紫茶沉淀中含用捣碎器恭85%放射性使空壳脱离沉淀细胞进一步培养后，可产生大量完整的子代噬菌体2
2 (3)S 型菌的无细胞抽提液试验 以上实验说明，加热杀死的 S 型细菌，在其细胞内可能存在一种具有遗传转化能力的 物质，它能通过某种方式进入 R 型细胞，并使 R 型细菌获得表达 S 型荚膜性状的遗传特性。 1944 年 O.T.Avery 等进行了以下实验： ①从活的 s 菌中抽提各种细胞成分(DNA，蛋白质，荚膜多糖等)。 ②对各种生化组分进行转化试验 结果表明，只有 S 型菌株的 DNA 才能 R 型菌株转化为 S 型；而且，DNA 纯度越高， 其转化效率也越高。 （二）噬菌体感染实验 把 E.coli 培养在以放射性 32PO4 3-或 35SO4 2- 作为磷源或硫源的组合培养基中，从而制备 出含 32P-DNA 核心的噬菌体或含 35S-蛋白质外壳的噬菌体。接着，又作了以下两组实验： 从下图两组实验中可清楚地看出，在噬菌体感染过程中，其蛋白质外壳根本未进入宿主 细胞。进入宿主细胞的虽只有 DNA，但却有自身的增殖、装配能力，最终会产生一大群既 有 DNA 核心、又有蛋白质外壳的完整的子代噬菌体粒。这就有力地证明，在其 DNA 中， 存在着包括合成蛋白质外壳在内的整套遗传信息
上清液中含775%放射性11吸附离心10min后沉淀中含3r用碎器25%放射性使空壳脱离沉淀细胞进一步培养后，可产生大量完整的子代噬菌体（三）植物病毒的重建实验（1956年）将烟草花叶病毒TMV放在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将它的蛋白质外壳与RNA核心相分离。结果发现裸露的RNA也能感染烟草，并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离到完整的TMV粒子（下图）。分离纯化HRVMHRV原始病杂合的罹病的重新分离毒株拆开的病毒病毒烟叶的病斑通过这3个具有历史意义的经典实验，得到了二个确信无疑的共同结论：只有核酸才是负载遗传信息的真正物质基础。二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式（一）7个水平1.细胞水平真核微生物和原核生物的大部分DNA都集中在细胞核或核区(核质体)中。在细胞水平上，在不同种微生物或同种微生物的不同细胞中，细胞核的数目常有所不同。2.细胞核水平真核生物的细胞核是有核膜包裹、形态固定的真核，核内的DNA与组蛋白结合在一起形成一种在光学显微镜下能见的核染色体：原核生物只有原始的无核膜包裹的呈松散状态存在的核区，其中的DNA呈环状双链结构，不与任何蛋白质相结合。它们都是该微生物遗传3
3 （三）植物病毒的重建实验（1956 年） 将烟草花叶病毒 TMV 放在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将它的蛋白质外壳与 RNA 核心相分离。结果发现裸露的 RNA 也能感染烟草，并使其患典型症状，而且在病斑中还能 分离到完整的 TMV 粒子（下图）。 通过这 3 个具有历史意义的经典实验，得到了一个确信无疑的共同结论：只有核酸才是 负载遗传信息的真正物质基础。 二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式 （一）7 个水平 1．细胞水平 真核微生物和原核生物的大部分 DNA 都集中在细胞核或核区(核质体)中。在细胞水平 上，在不同种微生物或同种微生物的不同细胞中，细胞核的数目常有所不同。 2．细胞核水平 真核生物的细胞核是有核膜包裹、形态固定的真核，核内的 DNA 与组蛋白结合在一起 形成一种在光学显微镜下能见的核染色体；原核生物只有原始的无核膜包裹的呈松散状态存 在的核区，其中的 DNA 呈环状双链结构，不与任何蛋白质相结合。它们都是该微生物遗传
信息的员主要负荷者，被称为核基因组、核染色体组或简称基因组另外，细胞质中，多数还存在着一类DNA含量少、能自主复制的核外染色体，如线粒体，叶绿体，卡巴颗粒，2um质粒（在细胞核内），质粒。3.染色体水平(1)染色体数(2)染色体倍数指同一细胞中相同染色体的套数。如果一个细胞中只有一套染色体，就称单倍体。在自然界中存在的微生物多数都是单倍体；如果一个细胞中含有两套功能相同的染色体，就称双倍体，只有少数微生物如酿酒酵母的营养细胞以及由两个单倍体性细胞通过接合形成的合子等少数细胞才是双倍体。在原核生物中，通过转化、转导或接合等过程而获得外源染色体片段时，只能形成一种不稳定的、称作部分双倍体的细胞。4.核酸水平(1)核酸种类绝大多数是DNA，少数是RNA，在真核生物中，DNA总是与缠绕的组蛋白同时存在的，而原核生物的DNA却是单独存在的。(2)核酸结构：绝大多数微生物的DNA是双链的，只有少数DNA为单链结构：RNA也有双链与单链之分，前者如多数真菌病毒，后者如多数RNA噬菌体。双链DNA有的呈环状，有的呈线状，有的则呈超螺旋状。(3)DNA长度即基因组的大小，一般可用 bp(碱基对)、kb(千碱基对)和 Mb(百万或兆碱基对)作单位。不同微生物基因组的大小差别很大。5.基因水平基因是生物体内一切具有自主复制能力的最小遗传功能单位，其物质基础是一条以直线排列、具有特定核苷酸序列的核酸片段。由众多基因构成了染色体。每个基因大体在1000-1500bp的范围，相对分子质量约为6.7×105。从基因的功能上来看，原核生物的基因是通过组成以下的调控系统而发挥其作用的：启动基因（启动子）操纵子操纵基因“结构基因基因调控系统“调节基因原核生物的基因调控系统是由一个操纵子和它的调节基因组成的。每一操纵子又包括3种功能上密切相关的基因一一结构基因、操纵基因和启动基因（又称启动子或启动区）。结构基因是决定某一多肽链结构的DNA模板，它是通过转录和转译过程来执行多肽链合成任务的。操纵基因是位于启动基因和结构基因之间的一段核誉酸序列，它与结构基因紧密连锁在一起，能通过与阻遏物(即阻遏蛋白)的结合与否，控制结构基因是否转录。启动基因是一种依赖于DNA的RNA多聚酶所识别的核苷酸序列，它既是DNA多聚酶的结合部位，又是转录的起始位点。所以，操纵基因和启动基因既不能转录出mRNA，也不能产生任何基因产物。调节基因一般处于与操纵子有一定间隔距离（通常小于100碱基）处，它是能调节操纵子中结构基因活动的基因。调节基因能转录出自已的mRNA，并经转译产生阻遇物，后者能识别并附着在操纵基因上。由于阻遏物和操纵基因的相互作用可使DNA双链无法分开，阻挡了RNA聚合两沿着结构基因移动，从而关闭了它的话动。真核生物的基因与原核生物的基因有许多不同处。最明显的是它们一般无操纵子结构，存在着大量不编码序列和重复序列，转录与转译在细胞中有空间分隔，以及基因被许多无编码功能的内含子阻隔，从而使编码序列变成不连续的外显子状态。6.密码子水平4
4 信息的员主要负荷者，被称为核基因组、核染色体组或简称基因组 另外，细胞质中，多数还存在着一类 DNA 含量少、能自主复制的核外染色体，如线粒 体，叶绿体，卡巴颗粒，2µm 质粒(在细胞核内)，质粒。 3．染色体水平 (1)染色体数 (2)染色体倍数 指同一细胞中相同染色体的套数。如果一个细胞中只有一套染色体，就 称单倍体。在自然界中存在的微生物多数都是单倍体；如果一个细胞中含有两套功能相同的 染色体，就称双倍体，只有少数微生物如酿酒酵母的营养细胞以及由两个单倍体性细胞通过 接合形成的合子等少数细胞才是双倍体。在原核生物中，通过转化、转导或接合等过程而获 得外源染色体片段时，只能形成一种不稳定的、称作部分双倍体的细胞。 4．核酸水平 (1)核酸种类 绝大多数是 DNA，少数是 RNA，在真核生物中，DNA 总是与缠绕的组 蛋白同时存在的，而原核生物的 DNA 却是单独存在的。 (2)核酸结构 绝大多数微生物的 DNA 是双链的，只有少数 DNA 为单链结构；RNA 也 有双链与单链之分，前者如多数真菌病毒，后者如多数 RNA 噬菌体。双链 DNA 有的呈环 状，有的呈线状，有的则呈超螺旋状。 (3)DNA 长度 即基因组的大小，一般可用 bp(碱基对)、kb(千碱基对)和 Mb(百万或兆 碱基对)作单位。不同微生物基因组的大小差别很大。 5．基因水平 基因是生物体内一切具有自主复制能力的最小遗传功能单位，其物质基础是一条以直线 排列、具有特定核苷酸序列的核酸片段。由众多基因构成了染色体。每个基因大体在 1000-1500bp 的范围，相对分子质量约为 6.7×105。从基因的功能上来看，原核生物的基因 是通过组成以下的调控系统而发挥其作用的： 原核生物的基因调控系统是由一个操纵子和它的调节基因组成的。每一操纵子又包括 3 种功能上密切相关的基因——结构基因、操纵基因和启动基因（又称启动子或启动区）。 结构基因是决定某一多肽链结构的 DNA 模板，它是通过转录和转译过程来执行多肽链合成 任务的。操纵基因是位于启动基因和结构基因之间的一段核苷酸序列，它与结构基因紧密连 锁在一起，能通过与阻遏物(即阻遏蛋白)的结合与否，控制结构基因是否转录。启动基因是 一种依赖于 DNA 的 RNA 多聚酶所识别的核苷酸序列，它既是 DNA 多聚酶的结合部位，又 是转录的起始位点。所以，操纵基因和启动基因既不能转录出 mRNA，也不能产生任何基 因产物。调节基因一般处于与操纵子有一定间隔距离(通常小于 100 碱基)处，它是能调节操 纵子中结构基因活动的基因。调节基因能转录出自己的 mRNA，并经转译产生阻遏物，后 者能识别并附着在操纵基因上。由于阻遏物和操纵基因的相互作用可使 DNA 双链无法分开， 阻挡了 RNA 聚合两沿着结构基因移动，从而关闭了它的话动。 真核生物的基因与原核生物的基因有许多不同处。最明显的是它们一般无操纵子结构， 存在着大量不编码序列和重复序列，转录与转译在细胞中有空间分隔，以及基因被许多无编 码功能的内含子阻隔，从而使编码序列变成不连续的外显子状态。 6．密码子水平
遗传密码是指DNA链上决定各具体氨基酸的特定核苷酸排列顺序。遗传密码的信息单位是密码子，每一密码子由3个核苷酸序列即1个三联体所组成。密码子一般都用mRNA上3个连续核苷酸序列来表示。7.核苷酸水平核苷酸单位(碱基单位)则是一个最低突变单位或交换单位。在绝大多数生物的DNA组分中，都只含腺苷酸(AMP)、胸苷酸(TMP)、鸟苷酸(GMP)和胞苷酸(CMP)4种脱氧核苷酸。①每个碱基对(bp)的平均相对分子质量约为650；②1×10°的dsDNA约为1.5kb(千碱基对)或0.5μum（长度）：③3nmoL碱基的重量约等于1μg。（二）原核生物的质粒1.定义和特点凡游离于原核生物核基因组以外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状的dsDNA分子，即cccDNA，就是典型的质粒。质粒具有麻花状的超螺旋结构，大小一般为1.5-300kb，相对分子质量为106-108，因此，仅相当约1%核基因组的大小。质粒上携带某些核基因组上所缺少的基因，使细菌等原核生物获得了某些对其生存并非必不可少的特殊功能，例如接合、产毒、抗药、固氮、产特殊酶或降解环境毒物等功能。质粒是一种独立存在于细胞内的复制子，如果其复制行为与核染色体的复制同步称为严紧型复制控制；另一类质粒的复制与核染色体的复制不同步，称为松驰型复制控制。少数质粒可在不同菌株间转移，如F因子或R因子等。含质粒的细胞在正常的培养基上受某些因素影响时，由于其复制受抑而核染色体的复制仍继续进行，从而引起子代细胞中不带质粒，此即质粒消除。某些质粒具有与核染色体发生整合与脱离的功能，如F因子，这类质粒又称附加体。整台，是指质粒（或温和噬菌体、病毒、转化因子)等小型非染色体DNA插入核基因组等大型DNA分子中的现象。此外，质粒还有重组的功能，可在质粒与质粒间、质粒与核染色体间发生基因重组。2．质粒在基因工程中的应用质粒具有许多有利于基因工程操作的优点，例如：①体积小，便于DNA的分离和操作；②呈环状，使其在化学分离过程中能保持性能稳定；③有不受核基因组控制的独立复制起始点：④拷贝数多，使外源DNA可很快扩增；③存在抗药性基因等选择性标记，便于含质粒克降的检出和选择。许多克隆载体（指能完成外源DNA片段复制的DNA分子）都是用质粒改建的，如含抗性基因、多拷贝、限制性内切酶的单个酶切位点和强启动子等特性的载体等。E.coli的pBR322质粒就是一个常用的克隆载体，其具体优点是：①体积小，仅4361bP；②在宿主E.coli中稳定地维持高拷贝数（20-30个/细胞）：③若用氯霉素抑制其宿主的蛋白质合成，则每个细胞可扩增到含1000-3000个质粒(约占核基因组的40%)：④分离极其容易：③可插入较多的外源DNA(不超过10kb)：结构完全清楚，各种核酸内切酶可酶解的位点可任意选用：③有两个选择性抗药标记（氨苄青霉素和四环素）：③可方便地通过转化作用导入宿主细胞。3.质粒的分离与鉴定质粒的分离一般可包括细胞的裂解、蛋白质和RNA的去除以及设法使质粒DNA与染色体DNA相分离等步骤，其中最后一步尤为关键。经分离后的质粒，可用电镜、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离和鉴定。质粒DNA经限制性内切核酸酶水解后，根据凝胶电泳谱上显示的区带数目，就可推出酶切位点的数目和测出不同区带（片段）的大小，并据此画出该质粒的限制性酶切图谱。。4.质粒的种类大致可分5类：结合性质粒，抗药性质粒，产细菌素和抗生素质粒，具生理功能的质粒，产毒质粒。5.典型质粒简介5
5 遗传密码是指 DNA 链上决定各具体氨基酸的特定核苷酸排列顺序。遗传密码的信息单 位是密码子，每一密码子由 3 个核苷酸序列即 1 个三联体所组成。密码子一般都用 mRNA 上 3 个连续核苷酸序列来表示。 7．核苷酸水平 核苷酸单位(碱基单位)则是一个最低突变单位或交换单位。在绝大多数生物的 DNA 组 分中，都只含腺苷酸(AMP)、胸苷酸(TMP)、鸟苷酸(GMP)和胞苷酸(CMP)4 种脱氧核苷酸。 ①每个碱基对(bp)的平均相对分子质量约为 650；②1×106 的 dsDNA 约为 1.5kb(千碱基对) 或 0.5µm (长度)；③3nmoL 碱基的重量约等于 1µg。 （二）原核生物的质粒 1．定义和特点 凡游离于原核生物核基因组以外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状的 dsDNA 分 子，即 cccDNA，就是典型的质粒。质粒具有麻花状的超螺旋结构，大小一般为 1.5-300kb， 相对分子质量为 106 -108，因此，仅相当约 1％核基因组的大小。质粒上携带某些核基因组上 所缺少的基因，使细菌等原核生物获得了某些对其生存并非必不可少的特殊功能，例如接合、 产毒、抗药、固氮、产特殊酶或降解环境毒物等功能。质粒是一种独立存在于细胞内的复制 子，如果其复制行为与核染色体的复制同步．称为严紧型复制控制；另一类质粒的复制与核 染色体的复制不同步，称为松弛型复制控制。少数质粒可在不同菌株间转移，如 F 因子或 R 因子等。含质粒的细胞在正常的培养基上受某些因素影响时，由于其复制受抑而核染色体的 复制仍继续进行，从而引起子代细胞中不带质粒，此即质粒消除。某些质粒具有与核染色体 发生整合与脱离的功能，如 F 因子，这类质粒又称附加体。整台，是指质粒(或温和噬菌体、 病毒、转化因子)等小型非染色体 DNA 插入核基因组等大型 DNA 分子中的现象。此外，质 粒还有重组的功能，可在质粒与质粒间、质粒与核染色体间发生基因重组。 2．质粒在基因工程中的应用 质粒具有许多有利于基因工程操作的优点，例如：①体积小，便于 DNA 的分离和操作； ②呈环状，使其在化学分离过程中能保持性能稳定；③有不受核基因组控制的独立复制起始 点；④拷贝数多，使外源 DNA 可很快扩增；⑤存在抗药性基因等选择性标记，便于含质粒 克隆的检出和选择。许多克隆载体(指能完成外源 DNA 片段复制的 DNA 分子)都是用质粒改 建的，如含抗性基因、多拷贝、限制性内切酶的单个酶切位点和强启动子等特性的载体等。 E.coli 的 pBR322 质粒就是一个常用的克隆载体，其具体优点是：①体积小，仅 4361bP；② 在宿主 E.coli 中稳定地维持高拷贝数(20-30 个/细胞)；③若用氯霉素抑制其宿主的蛋白质合 成，则每个细胞可扩增到含 1000-3000 个质粒(约占核基因组的 40％)；④分离极其容易；⑤ 可插入较多的外源 DNA(不超过 10 kb)；⑥结构完全清楚，各种核酸内切酶可酶解的位点可 任意选用；⑦有两个选择性抗药标记(氨苄青霉素和四环素)；⑧可方便地通过转化作用导入 宿主细胞。 3．质粒的分离与鉴定 质粒的分离一般可包括细胞的裂解、蛋白质和 RNA 的去除以及设法使质粒 DNA 与染 色体 DNA 相分离等步骤，其中最后一步尤为关键。经分离后的质粒，可用电镜、琼脂糖或 聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离和鉴定。质粒 DNA 经限制性内切核酸酶水解后，根据凝胶电泳 谱上显示的区带数目，就可推出酶切位点的数目和测出不同区带(片段)的大小，并据此画出 该质粒的限制性酶切图谱。 4．质粒的种类 大致可分 5 类：结合性质粒，抗药性质粒，产细菌素和抗生素质粒，具生理功能的质粒， 产毒质粒。 5．典型质粒简介