Total rna in 0.5 NaCl HoO 0. 5M NaCl Add solution of total RNA in Wash with 0.5M Elute mRNA .5M NacI 5 Nacl to remove residual rRNA IRNA from column with H2O )chromatography column 6 Eukaryotic mRNA Cellulose matrix with covalently attached with poly(A)tails hybridizes to oligo(dT) oligo(dT) chains chains on cellulose: rRNA, tRNA pass right hrough column Collect and evaluate mRNA solution
(3)cDNA的合成 ①cDNA第一链合成 逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。 用 Oligo dT(或随机引物)作引物,合成 CDNA的第一链。 3'AAAAAAA mRNA 5 5 TTTTTTT CDNA K反转录酶 O|odT引物
反转录酶 （3）cDNA的合成 ① cDNA第一链合成 逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。 用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成 cDNA的第一链。 mRNA cDNA 3’ 5’ AAAAAAA 5’ TTTTTTT Oligo dT引物
②降解mRNA模板 用碱处理或用 RNase h降解mRNA-DNA杂交分子 中的mRNA。 3 mRNA 5 5’引物 CDNA 反转录酶 3 3 mRNA 5 5引物 cDNA第一 碱或 RNaseH 5’物 CDNA第一链
用碱处理或用RNase H降解mRNA-DNA杂交分子 中的mRNA。 mRNA cDNA 3’ 3’ 5’ 5’ 引物 反转录酶 mRNA cDNA第一链 3’ 3’ 5’ 5’ 引物 5’ 引物 cDNA第一链 3’ ② 降解mRNA模板 碱 或RNaseH
③cDNA第二链合成 剩下的CDNA单链的3未端一般形成一个弯回来 的双链发卡结构(机理不明),可成为合成第二 条CDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链 DNA。 CDNA第一链 CDNA第二链合成 NA聚合酶 cDNA第一链 3 cDNA第二链
剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来 的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二 条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链 DNA。 5’ cDNA第一链 cDNA第二链合成 DNA聚合酶 cDNA第一链 cDNA第二链 5’ 3’ ③ cDNA第二链合成
④去掉发卡结构 用核酸酶S1可以切掉发卡结构(但这会导致 CDNA中有用的序列被切掉!)。 5 cDNA第一链 3 CDNA第二链 核酸酶S1 5 CDNA第一链 3 cDNA第二链 5
④去掉发卡结构 核酸酶S1 用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致 cDNA中有用的序列被切掉！）。 cDNA第一链 cDNA第二链 5’ 3’ cDNA第一链 cDNA第二链 5’ 3’ 5’ 3’