Poly-A tail mRNA 3"AAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 5 计计 Add poly-dT primer AAAAA Add reverse transcript AAAA 5 Double-stranded duplex 3 DNA synthesis continues AAAAA Single-stranded CDNA TTTTTTTTTTTTTTTTTTT Add DNA polymerase I AAAAA Add S nuclease cleave hairpin STT!!IT Double-stranded cDNA
妙用 RNaseh 这种酶能识别 MRNA-CDNA杂交分子中的 mRNA,并将其降解成许多小片断。 小片断正好成为DNA聚合酶的引物,用来合 成冈崎片断。 DNA Pol除去引物并修补后再使用DNA连接 酶连成一整条DNA链
这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的 mRNA，并将其降解成许多小片断。 妙用RNaseH 小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合 成冈崎片断。 DNA Pol I除去引物并修补后再使用DNA连接 酶连成一整条DNA链
3 mRNA 5同物cDNA反转录酶 3 mRNA 5’引物 cDNA第一链 RNaseH DNA DNA 3'mRNA 聚合酶mRNA 聚合酶mRNA 5 cDNA第一链 去引物 DNA ligase 35 cDNA第二链 CDNA第一链
mRNA cDNA 3’ 5’ 引物 反转录酶 mRNA cDNA第一链 3’ 5’ 引物 mRNA cDNA第一链 3’ 5’ mRNA mRNA DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 cDNA第二链 cDNA第一链 3’ 5’ RNaseH 去引物 DNA ligase
mRNA5匚 Anneal oligo(dT)12-18 primers mRNA 5 LaMLa 3 CdNA Sn Add reverse transcriptase and substrates datP dTtP dGTP. dcrP Heteroduplex mRNA 3 CDNA Add RNase H. DNA polymerase, and dATP. /TTP,dGTP. dCT; mRNA degraded by RNase H 面5 DNA poling F erase copies first-strand DNA cDNA using RNA segments as primer polymerase -m DNA fragments joined by DNA ligase DNA duplex CDNA CDNA auLIS (e) EcoRI linkers T4 DNA ligas LA 4H41141(H LAHHHHHE E EcoRi ended-cDNA duplexes for cloning
5.CDNA与载体连接: 在双链CDNA末端接上人工接头,即可与载体连 接,转入受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cD№A的3'端分 别加上几个C或G,成为粘性未端。 接上人工接头 粘性末端 1末端转移酶ccc CCC
在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连 接，转入受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分 别加上几个C或G，成为粘性末端。 5. cDNA与载体连接： 接上人工接头 粘性末端 CCC 末端转移酶 CCC