《畜牧与兽医》：水牛CART基因的克隆测序及蛋白质结构与功能预测（2020年）

畜牧与兽医2020年第52卷第2期 于农淇,鄢胜飞,覃广胜,等.水牛CART基因的克隆测序及蛋白质结构与功能预测[J].畜牧与兽医,2020,52(2):1-6 YU N Q, YAN S F, QIN G S, et al. Cloning, sequencing and bioinformatics analysis of the CART gene in buffalo [J. Animal Husbandry Veterinary Medi- cine,2020,52(2):1-6. 水牛CART基因的克隆测序及蛋白质结构与功能预测 于农淇,鄢胜飞,覃广胜,尚江华,郑海英,杨春艳 (中国农业科学院广西水牛研究所/广西水牛遗传繁育重点实验室,广西南宁530001) 摘要:为探讨水牛可卡因-苯丙胺调节转录肽( cocaine- and amphetamine-regulated transcript,CART)基因功能,以水牛卵巢组织RNA转录的 cDNA为模板,参考 GenBank预测的水牛CART基因组序列设计引物,采用PCR和在线生信分析软件对CART基因进行克隆和蛋白质结构预测分 析。结果显示:水牛CART基因CDs区全序列长为351bp,编码116个氨基酸;对所得核酸序列和蛋白质结构分析预测显示,水牛CART基因与 美洲野牛、野牦牛、普通牛、羊、双峰驼、单峰驼、野猪、马、非洲野驴、人类及猕猴相似程度分别为100%、%8%、100%、98%、91%、9%」 78%、85%、85%、81%、90%;Me分析显示在多胃反刍动物间有较高同源性;蛋白质结构预测显示,CART蛋白含有N端信号肽,是分泌蛋 白,功能与神经、辅酶和离子结合相关。 关键词:CART;水牛;蛋白质功能预测 中图分类号:S823.83 文献标志码:A文章编号:0529-5130(2020)02-0001-06 Cloning, sequencing and bioinformatics analysis of the cart gene in buffalo YU Nongqi, YAN Shengfei, QIN Guangsheng, SHANG Jianghua, ZHENG Haiying, YANG Chunyan Guangxi Key Laboratory of Buffalo Genetics, Breeding and Reproduction/Buffalo Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530001, China) Abstract: In this study, the cocaine-and amphetamine-regulated transcript( CART) gene of buffalos was cloned and its protein structure was predicted. The cDNA transcribed by RNA was extracted from the ovaries of buffalos as templates, primers were designed according to the genomic sequence of CARt predicted by GenBank so as to amplify and sequence the CDS region of the Cart gene of theanimals. The results showed that the total length of the CDS region of the buffalo CART gene was 351 bp, encoding 116 amino acids. The analysis of nucleic acid sequence and protein structure indicated that the similarities between the buffalo Cart gene and that of American bison, wild yak, common cattle, sheep, bactrian camel and single hump camel, wild boar, horse and African wild donkey, human and macaque were 100%, 98% 100%6,98%,91%,91%, 78%,85%,85%,81% and 90%, respectively. The prediction of protein structure indicated that the CArT pro- tein contained N-terminal signal peptides confirming it to be a secretory protein. The present study laid a foundation for further research on the function of the Cart gene in buffalos Keywords: CART; buffalo; protein function prediction 可卡因-苯丙胺调节转录肽( cocaine- and an关2-4。水牛CART基因( Gene id:102413682,NW phetamine- regulated transcript,CART)广泛分布于中005785813)全长为2059bp,有3个CDS区,mRNA 枢神经系统和外周神经系统,被认为是参与食物摄入全长775b,CDS全长312bp。前人对水牛CART及 调控的主要无食欲肽。CART是一种关键的神经递其基因的研究不多,尤其缺少奶水牛上该基因结构、 质和激素,参与调节多种生物过程,包括食物摄入、表达蛋白分析的相关研究。本研究通过克隆奶水牛 维持体重、奖励和成瘾、应激反应、心理刺激效应和CART基因CDS区序列,分析研究其编码蛋白质的氨 内分泌功能,并被报道与家畜繁殖力、生产性能有基酸结构及蛋白定位、互作,丰富了CART基因数据 信息,为今后CART对水牛内分泌和生长繁殖作用的 收稿日期:2019-03-21;修回日期:2019-12-16 研究提供数据支撑。 基因项目:广西科技计划项目(桂科AB16380040);广西水牛研 所基本科研业务费项目(水牛基180503) 1材料与方法 第一作者:于农淇(1991-):女,壮族,硕士 令·通信作者:杨春艳,副研究员,研究方向为动物遗传育种与繁1.1材料 E-mail:86748227(@qg.como 试验所用水牛卵巢组织样本来自广西南宁屠宰

于农淇， 鄢胜飞， 覃广胜， 等． 水牛 ＣＡＲＴ 基因的克隆测序及蛋白质结构与功能预测 ［Ｊ］． 畜牧与兽医， ２０２０， ５２ （２）： １－６． ＹＵ Ｎ Ｑ， ＹＡＮ Ｓ Ｆ， ＱＩＮ Ｇ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｃｌｏｎｉｎｇ， ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＡＲＴ ｇｅｎｅ ｉｎ ｂｕｆｆａｌｏ ［Ｊ］． Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ＆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉ⁃ ｃｉｎｅ， ２０２０， ５２ （２）： １－６． 水牛 ＣＡＲＴ 基因的克隆测序及蛋白质结构与功能预测 于农淇， 鄢胜飞， 覃广胜， 尚江华， 郑海英， 杨春艳∗ （中国农业科学院广西水牛研究所／ 广西水牛遗传繁育重点实验室， 广西 南宁 ５３０００１） 摘要： 为探讨水牛可卡因－苯丙胺调节转录肽 （ ｃｏｃａｉｎｅ－ａｎｄ ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ， ＣＡＲＴ） 基因功能， 以水牛卵巢组织 ＲＮＡ 转录的 ｃＤＮＡ 为模板， 参考 ＧｅｎＢａｎｋ 预测的水牛 ＣＡＲＴ 基因组序列设计引物， 采用 ＰＣＲ 和在线生信分析软件对 ＣＡＲＴ 基因进行克隆和蛋白质结构预测分 析。 结果显示： 水牛 ＣＡＲＴ 基因 ＣＤＳ 区全序列长为 ３５１ ｂｐ， 编码 １１６ 个氨基酸； 对所得核酸序列和蛋白质结构分析预测显示， 水牛 ＣＡＲＴ 基因与 美洲野牛、 野牦牛、 普通牛、 羊、 双峰驼、 单峰驼、 野猪、 马、 非洲野驴、 人类及猕猴相似程度分别为 １００％、 ９８％、 １００％、 ９８％、 ９１％、 ９１％、 ７８％、 ８５％、 ８５％、 ８１％、 ９０％； Ｍｅｇａ 分析显示在多胃反刍动物间有较高同源性； 蛋白质结构预测显示， ＣＡＲＴ 蛋白含有 Ｎ 端信号肽， 是分泌蛋 白， 功能与神经、 辅酶和离子结合相关。 关键词： ＣＡＲＴ； 水牛； 蛋白质功能预测 中图分类号： Ｓ８２３􀆰 ８３ 文献标志码： Ａ 文章编号： ０５２９－５１３０（２０２０）０２－０００１－０６ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＡＲＴ ｇｅｎｅ ｉｎ ｂｕｆｆａｌｏ ＹＵ Ｎｏｎｇｑｉ， ＹＡＮ Ｓｈｅｎｇｆｅｉ， ＱＩＮ Ｇｕａｎｇｓｈｅｎｇ， ＳＨＡＮＧ Ｊｉａｎｇｈｕａ， ＺＨＥＮＧ Ｈａｉｙｉｎｇ， ＹＡＮＧ Ｃｈｕｎｙａｎ ∗ （Ｇｕａｎｇｘｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ／ Ｂｕｆｆａｌｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｎａｎｎｉｎｇ ５３０００１， Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ， ｔｈｅ ｃｏｃａｉｎｅ－ａｎｄ ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ （ＣＡＲＴ） ｇｅｎｅ ｏｆ ｂｕｆｆａｌｏｓ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｗａｓ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ． Ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｂｙ ＲＮＡ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｏｖａｒｉｅｓ ｏｆ ｂｕｆｆａｌｏｓ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ， ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＣＡＲＴ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｂｙ ＧｅｎＢａｎｋ ｓｏ ａｓ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｈｅ ＣＤＳ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＡＲＴ ｇｅｎｅ ｏｆ ｔｈｅａｎｉｍａｌｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤＳ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｕｆｆａｌｏ ＣＡＲＴ ｇｅｎｅ ｗａｓ ３５１ ｂｐ， ｅｎｃｏｄｉｎｇ １１６ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ． Ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｂｕｆｆａｌｏ ＣＡＲＴ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｔｈａｔ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｂｉｓｏｎ， ｗｉｌｄ ｙａｋ， ｃｏｍｍｏｎ ｃａｔｔｌｅ， ｓｈｅｅｐ， ｂａｃｔｒｉａｎ ｃａｍｅｌ ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ ｈｕｍｐ ｃａｍｅｌ， ｗｉｌｄ ｂｏａｒ， ｈｏｒｓｅ ａｎｄ Ａｆｒｉｃａｎ ｗｉｌｄ ｄｏｎｋｅｙ， ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍａｃａｑｕｅ ｗｅｒｅ １００％， ９８％， １００％， ９８％， ９１％， ９１％， ７８％， ８５％， ８５％， ８１％ ａｎｄ ９０％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＣＡＲＴ ｐｒｏ⁃ ｔｅｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｃｏｎｆｉｒｍｉｎｇ ｉｔ ｔｏ ｂｅ ａ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ ｌａｉｄ ａ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＡＲＴ ｇｅｎｅ ｉｎ ｂｕｆｆａｌｏｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： ＣＡＲＴ； ｂｕｆｆａｌｏ； ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ 可卡因－苯丙胺调节转录肽 （ ｃｏｃａｉｎｅ － ａｎｄ ａｍ⁃ ｐｈｅｔａｍｉｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ， ＣＡＲＴ） 广泛分布于中 枢神经系统和外周神经系统， 被认为是参与食物摄入 调控的主要无食欲肽［１］ 。 ＣＡＲＴ 是一种关键的神经递 质和激素， 参与调节多种生物过程， 包括食物摄入、 维持体重、 奖励和成瘾、 应激反应、 心理刺激效应和 内分泌功能， 并被报道与家畜繁殖力、 生产性能有 收稿日期： ２０１９－０３－２１ ； 修回日期： ２０１９－１２－１６ 基因项目： 广西科技计划项目 （桂科 ＡＢ１６３８００４０）； 广西水牛研 究所基本科研业务费项目 （水牛基 １８０５０３） 第一作者： 于农淇 （１９９１－）： 女， 壮族， 硕士 ∗ 通信作者： 杨春艳， 副研究员， 研究方向为动物遗传育种与繁 殖， Ｅ－ｍａｉｌ： ８６７４８２２７＠ ｑｑ􀆰 ｃｏｍ。 关［２－４］ 。 水牛 ＣＡＲＴ 基因（Ｇｅｎｅ ＩＤ： １０２４１３６８２，ＮＷ＿ ００５７８５８１３）全长为 ２ ０５９ ｂｐ， 有 ３ 个 ＣＤＳ 区， ｍＲＮＡ 全长 ７７５ ｂｐ， ＣＤＳ 全长 ３１２ ｂｐ。 前人对水牛 ＣＡＲＴ 及 其基因的研究不多， 尤其缺少奶水牛上该基因结构、 表达蛋白分析的相关研究。 本研究通过克隆奶水牛 ＣＡＲＴ 基因 ＣＤＳ 区序列， 分析研究其编码蛋白质的氨 基酸结构及蛋白定位、 互作， 丰富了 ＣＡＲＴ 基因数据 信息， 为今后 ＣＡＲＴ 对水牛内分泌和生长繁殖作用的 研究提供数据支撑。 １ 材料与方法 １􀆰 １ 材料 试验所用水牛卵巢组织样本来自广西南宁屠宰 畜牧与兽医 ２０２０ 年 第 ５２ 卷 第 ２ 期 ·１·

Animal Husbandry Veterinary Medicine 2020 Vol. 52 No. 2 场,卵巢离体后立刻放入液氮中保存,转移至实验室 TRIzol加入0.6mL异丙醇,混匀放置5~10min,4 后置于液氮罐中待用。 ℃12000r/min离心15min。每毫升 trizol加入1 PremiⅸxTq酶、DL2000 DNA marker、反转录试mL75%乙醇,温和震荡使沉淀悬浮,4℃7500r 剂盒、pMDl8-T载体、T4连接酶、DH5α感受态大min离心5min。弃去酒精,所得沉淀室温干燥5~10 肠杆菌购自 TaKara公司,DNA纯化回收试剂盒、质min后用60℃DEPC处理纯净水溶解,紫外分光光 粒小提试剂盒购自天根公司,TRol试剂、氯仿、无度计检测浓度及质量。 水乙醇等试剂购自天地扬公司。 依照反转录试剂盒操作说明操作反转录cDNA。 1.2方法 所得cDNA溶液置于-20℃保存。 1.2.1水牛卵巢组织RNA提取及反转录 1.2.2引物设计与合成 将水牛卵巢组织剪成小块放入研钵,加入液氮反 参考NCBI数据库( Gene id:102413682,NW 复、充分研磨。每50~100mg组织加入1 mL TRIzol,005785813)中预测的水牛CART基因mRNA序列 再用电动匀浆器充分匀浆1~2min,12000r/min离使用NCBI在线引物设计软件设计引物扩增其CDS区 心5min,弃沉淀,每毫升 trizol加入200μ氯仿,序列,引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成 手动混匀15s,室温放置10min。4℃1200r/min引物信息见表1。 离心15min,取上层水相转移至新的离心管,每毫升 表1水牛CART基因扩增引物序列 引物名称 引物序列(5′→3′) 退火温度/℃ 扩增产物长度/bp F. GCCTACAGACGGTTGACCC CART-CDS 573 R. TIGCTAAAGCCAGACTCCAGG 1.2.3PCR扩增及载体构建 SwisS-modEl(htTp: //swiss-model. expasy. org/)1es PCR反应体系25μL: Premix Taq12.5μL,软件分析蛋白质理化性质、二级和三级结构,利用 dH2O9.5μ,100ng/μ L CDNA模板1μL,10 ng/ PSORT II prediction在线软件(hts:// psort.hge.jn μL上下游引物各1μL,dH2O15.75μL。PCR反应fom2htm)预测CART蛋白的亚细胞定位, STRING 条件:98℃预变性3min;98℃变性30s,62℃退蛋白质互作数据库检索水牛CART蛋白质序列,在 火30s.72℃延伸90s,共35个循环;72℃延伸6http://kiharalab.org/web/results.phpjob_id=49337 min,4℃保存。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检网站上进行蛋白质功能预测。 测,用DNA纯化回收试剂盒切胶回收。将回收的 PCR产物与pMD18-T载体通过T4连接酶过夜连接, 2结果与分析 转化感受态大肠杆菌DH5α,37℃、100r/min培养12.1水牛CART基因的PCR扩增 h,涂于含有Amp、X-gl、IPTG的IB固体培养基 紫外分光光度计检测所得RNA纯度及浓度较好。 上,37℃培养12h后挑取阳性单克隆扩增培养。用以反转录所得ωDNA为模板,用所设计引物扩增结果 质粒小提试剂盒提取质粒后PCR检测鉴定,将检测如图1所示。由图可见,所设计引物PCR扩增产物 阳性的质粒送北京奧科鼎盛生物科技有限公司测序条带清晰且特异性良好,与预期大小相符,可进行下 鉴定 步试验。 1.2.4生物信息学分析 2.2水牛CART基因克隆及测序 CART基因序列比对及同源性使用NCBI在线分 扩增产物切胶回收后转化大肠杆菌,经挑选培养 析,使用MEGA7.0软件构建系统进化树。通过在线后送测序鉴定。菌液PCR产物约570bp大小(图2) 软件 TMHMM2.0(htp:/w.chs.du.dk/ services/为阳性克隆,将扩大繁殖所得菌液送测序公司测序。 TMHMM/)预测分析跨膜结构及信号肽,使用Prot测序结果与NCBI序列对比显示扩增获得序列与 param(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/pot-CART基因CDS区域一致,与预期相同(图3、图 param)、 Prot scale(htts://web. expasy.og/mp/4)。所获得的水牛CART基因CDS序列全长为351 scores55205.txt)、 SOPMA(htp://npsa- pbil. ibep.f/bp,编码116个氨基酸。 cgi-bin/npsa_automat. pl? page= npsa_sopma. html)

场， 卵巢离体后立刻放入液氮中保存， 转移至实验室 后置于液氮罐中待用。 Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ 酶、 ＤＬ２０００ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ、 反转录试 剂盒、 ｐＭＤ１８－Ｔ 载体、 Ｔ４ 连接酶、 ＤＨ５α 感受态大 肠杆菌购自 ＴａＫａＲａ 公司， ＤＮＡ 纯化回收试剂盒、 质 粒小提试剂盒购自天根公司， ＴＲＩｚｏｌ 试剂、 氯仿、 无 水乙醇等试剂购自天地扬公司。 １􀆰 ２ 方法 １􀆰 ２􀆰 １ 水牛卵巢组织 ＲＮＡ 提取及反转录 将水牛卵巢组织剪成小块放入研钵， 加入液氮反 复、 充分研磨。 每 ５０～１００ ｍｇ 组织加入 １ ｍＬ ＴＲＩｚｏｌ， 再用电动匀浆器充分匀浆 １ ～ ２ ｍｉｎ， １２ ０００ ｒ／ ｍｉｎ 离 心 ５ ｍｉｎ， 弃沉淀， 每毫升 ＴＲＩｚｏｌ 加入 ２００ μＬ 氯仿， 手动混匀 １５ ｓ， 室温放置 １０ ｍｉｎ。 ４ ℃ １２ ０００ ｒ／ ｍｉｎ 离心 １５ ｍｉｎ， 取上层水相转移至新的离心管， 每毫升 ＴＲＩｚｏｌ 加入 ０􀆰 ６ ｍＬ 异丙醇， 混匀放置 ５ ～ １０ ｍｉｎ， ４ ℃ １２ ０００ ｒ／ ｍｉｎ 离心 １５ ｍｉｎ。 每毫升 ＴＲＩｚｏｌ 加入 １ ｍＬ ７５％乙醇， 温和震荡使沉淀悬浮， ４ ℃ ７ ５００ ｒ／ ｍｉｎ 离心 ５ ｍｉｎ。 弃去酒精， 所得沉淀室温干燥 ５ ～ １０ ｍｉｎ 后用 ６０ ℃ ＤＥＰＣ 处理纯净水溶解， 紫外分光光 度计检测浓度及质量。 依照反转录试剂盒操作说明操作反转录 ｃＤＮＡ。 所得 ｃＤＮＡ 溶液置于－２０ ℃保存。 １􀆰 ２􀆰 ２ 引物设计与合成 参考 ＮＣＢＩ 数据库 （ Ｇｅｎｅ ＩＤ： １０２４１３６８２， ＮＷ ＿ ００５７８５８１３） 中预测的水牛 ＣＡＲＴ 基因 ｍＲＮＡ 序列， 使用 ＮＣＢＩ 在线引物设计软件设计引物扩增其 ＣＤＳ 区 序列， 引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。 引物信息见表 １。 表 １ 水牛 ＣＡＲＴ 基因扩增引物序列 引物名称 引物序列 （５′ →３′ ） 退火温度／ ℃ 扩增产物长度／ ｂｐ ＣＡＲＴ－ＣＤＳ Ｆ： ＧＣＣＴＡＣＡＧＡＣＧＧＴＴＧＡＣＣＣ Ｒ： ＴＴＧＣＴＡＡＡＧＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＧＧ ６０ ５７３ １􀆰 ２􀆰 ３ ＰＣＲ 扩增及载体构建 ＰＣＲ 反 应 体 系 ２５ μＬ： Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ １２􀆰 ５ μＬ， ｄｄＨ２Ｏ ９􀆰 ５ μＬ， １００ ｎｇ ／ μＬ ｃＤＮＡ 模板 １ μＬ， １０ ｎｇ ／ μＬ 上下游引物各 １ μＬ， ｄｄＨ２Ｏ １５􀆰 ７５ μＬ。 ＰＣＲ 反应 条件： ９８ ℃ 预变性 ３ ｍｉｎ； ９８ ℃ 变性 ３０ ｓ， ６２ ℃ 退 火 ３０ ｓ， ７２ ℃延伸 ９０ ｓ， 共 ３５ 个循环； ７２ ℃ 延伸 ５ ｍｉｎ， ４ ℃ 保存。 ＰＣＲ 产物用 ２％琼脂糖凝胶电泳检 测， 用 ＤＮＡ 纯化回收试剂盒切胶回收。 将回收的 ＰＣＲ 产物与 ｐＭＤ１８－Ｔ 载体通过 Ｔ４ 连接酶过夜连接， 转化感受态大肠杆菌 ＤＨ５α， ３７ ℃ 、 １００ ｒ／ ｍｉｎ 培养 １ ｈ， 涂于含有 Ａｍｐ、 Ｘ－ｇａｌ、 ＩＰＴＧ 的 ＬＢ 固体培养基 上， ３７ ℃培养 １２ ｈ 后挑取阳性单克隆扩增培养。 用 质粒小提试剂盒提取质粒后 ＰＣＲ 检测鉴定， 将检测 阳性的质粒送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序 鉴定。 １􀆰 ２􀆰 ４ 生物信息学分析 ＣＡＲＴ 基因序列比对及同源性使用 ＮＣＢＩ 在线分 析， 使用 ＭＥＧＡ ７􀆰 ０ 软件构建系统进化树。 通过在线 软件 ＴＭＨＭＭ ２􀆰 ０ （ ｈｔｔｐ： ／ ／ ｗｗｗ． ｃｂｓ． ｄｔｕ． ｄｋ ／ ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ ＴＭＨＭＭ／ ）预测分析跨膜结构及信号肽， 使用 Ｐｒｏｔ ｐａｒａｍ（ｈｔｔｐｓ： ／ ／ ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ ／ ｃｇｉ－ｂｉｎ ／ ｐｒｏｔｐａｒａｍ ／ ｐｒｏｔ⁃ ｐａｒａｍ ）、 Ｐｒｏｔ ｓｃａｌｅ （ ｈｔｔｐｓ： ／ ／ ｗｅｂ． ｅｘｐａｓｙ． ｏｒｇ ／ ｔｍｐ ／ ｓｃｏｒｅｓ１５５２０５􀆰 ｔｘｔ）、ＳＯＰＭＡ（ ｈｔｔｐ： ／ ／ ｎｐｓａ － ｐｂｉｌ． ｉｂｃｐ． ｆｒ／ ｃｇｉ－ ｂｉｎ ／ ｎｐｓａ ＿ ａｕｔｏｍａｔ． ｐｌ？ ｐａｇｅ ＝ ｎｐｓａ ＿ ｓｏｐｍａ． ｈｔｍｌ）、 ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ（ ｈｔｔｐ： ／ ／ ｓｗｉｓｓ－ｍｏｄｅｌ． ｅｘｐａｓｙ． ｏｒｇ ／ ）在线 软件分析蛋白质理化性质、 二级和三级结构， 利用 ＰＳＯＲＴ ＩＩ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ 在线软件 （ ｈｔｔｐｓ： ／ ／ ｐｓｏｒｔ． ｈｇｃ． ｊｐ ／ ｆｏｒｍ２􀆰 ｈｔｍｌ）预测 ＣＡＲＴ 蛋白的亚细胞定位， ＳＴＲＩＮＧ 蛋白质互作数据库检索水牛 ＣＡＲＴ 蛋白质序列， 在 ｈｔｔｐ： ／ ／ ｋｉｈａｒａｌａｂ． ｏｒｇ ／ ｗｅｂ ／ ｒｅｓｕｌｔｓ． ｐｈｐ？ ｊｏｂ ＿ ｉｄ ＝ ４９３３７ 网站上进行蛋白质功能预测。 ２ 结果与分析 ２􀆰 １ 水牛 ＣＡＲＴ 基因的 ＰＣＲ 扩增 紫外分光光度计检测所得 ＲＮＡ 纯度及浓度较好。 以反转录所得 ｃＤＮＡ 为模板， 用所设计引物扩增结果 如图 １ 所示。 由图可见， 所设计引物 ＰＣＲ 扩增产物 条带清晰且特异性良好， 与预期大小相符， 可进行下 一步试验。 ２􀆰 ２ 水牛 ＣＡＲＴ 基因克隆及测序 扩增产物切胶回收后转化大肠杆菌， 经挑选培养 后送测序鉴定。 菌液 ＰＣＲ 产物约 ５７０ ｂｐ 大小 （图 ２） 为阳性克隆， 将扩大繁殖所得菌液送测序公司测序。 测序结果与 ＮＣＢＩ 序列对比显示扩增获得序列与 ＣＡＲＴ 基因 ＣＤＳ 区域一致， 与预期相同 （图 ３、 图 ４）。 所获得的水牛 ＣＡＲＴ 基因 ＣＤＳ 序列全长为 ３５１ ｂｐ， 编码 １１６ 个氨基酸。 ·２· Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ＆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０２０ Ｖｏｌ􀆰 ５２ Ｎｏ􀆰 ２

畜牧与兽医2020年第52卷第2期 2000 750 570bp M.DL000 Marker;1~3.PCR产物 图1水牛CART基因PCR产物电泳分析 M.DL2000 Marker;neg-1,neg-2,neg-3.阴性克隆PCR产物 os-1.阳性克隆PCR产物 图2水牛CART基因阳性单克隆PCR产物电泳分析 CGAGTTTCAGCACCATGGAGAGCC CTGCTACCTTTGCTGGGCGCCTTAGCCCA GCCGAGCTCCAGCCCCGAGCCCTGGACATCTACTCCGCCGTGGAGGATGCCTCC G AL A 0 E D A E L 0 PR A L D I FAAGAAGCTCAAGAGTAAACGTATTCCAATTT) YE K KYG 0 v: C AG E0C AV R K GKL 5 C AATTCCTTCCTCCTGAAGTGCTTATGAGGCACCCACGCTTCTCCATAAGCCCCCTCCCCACT NS FL LK C 图3水牛CART基因克隆测序及预测的蛋白编码 起始位点ATG 终止位点TGA 342bp 426bp 858bp 390bp 5°-UTR 外显子1 内含子 外显子2 内含子 外显子3 图4水牛CART基因组序列结构示意图 2.3水牛CART基因同源性及系统进化树分析 与猕猴相似程度为91%,与马、驴相似程度为85% NCBI序列相似性分析(htps:// blast.ncbi.nlm.与人类、野猪相似程度分别为81%、78%。Mega7.0 nih. gov/ Blast.cgi)对所得水牛序列与 GenBank中与美分析结果见图5,由图可知水牛与黄牛、牦牛和美洲 洲野牛、野牦牛、普通牛、羊、双峰驼与单峰驼、野野牛,以及绵羊最早聚为一类,同源性较高,说明 猪、马和驴、人类与猕猴基因序列进行比对分析,使CART基因在多胃反刍动物中保守性较强。单峰驼与 用Mega7.0软件构建系统进化树,参考序列及相似双峰驼、野猪、马与驴各聚为一类,共3条分支,与 性分析结果见表2。所得水牛CART基因序列与美洲牛羊共聚为一大分支,人类与猕猴聚为一类,为另 野牛、普通牛相似程度为100%,与野牦牛、羊相似大分支。聚类分析可见马与驴分化最早,最晚为单峰 程度为哭8%,与双峰驼、单峰驼相似程度为%,驼与双峰驼

Ｍ． ＤＬ２０００ Ｍａｒｋｅｒ； １～ ３􀆰 ＰＣＲ 产物 图 １ 水牛 ＣＡＲＴ 基因 ＰＣＲ 产物电泳分析 Ｍ． ＤＬ２０００ Ｍａｒｋｅｒ； ｎｅｇ－ １， ｎｅｇ － ２， ｎｅｇ － ３􀆰 阴性克隆 ＰＣＲ 产物； ｐｏｓ－１􀆰 阳性克隆 ＰＣＲ 产物 图 ２ 水牛 ＣＡＲＴ 基因阳性单克隆 ＰＣＲ 产物电泳分析 图 ３ 水牛 ＣＡＲＴ 基因克隆测序及预测的蛋白编码 图 ４ 水牛 ＣＡＲＴ 基因组序列结构示意图 ２􀆰 ３ 水牛 ＣＡＲＴ 基因同源性及系统进化树分析 ＮＣＢＩ 序列相似性分析 （ ｈｔｔｐｓ： ／ ／ ｂｌａｓｔ． ｎｃｂｉ． ｎｌｍ． ｎｉｈ．ｇｏｖ ／ Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）对所得水牛序列与 ＧｅｎＢａｎｋ 中与美 洲野牛、 野牦牛、 普通牛、 羊、 双峰驼与单峰驼、 野 猪、 马和驴、 人类与猕猴基因序列进行比对分析， 使 用 Ｍｅｇａ ７􀆰 ０ 软件构建系统进化树， 参考序列及相似 性分析结果见表 ２。 所得水牛 ＣＡＲＴ 基因序列与美洲 野牛、 普通牛相似程度为 １００％， 与野牦牛、 羊相似 程度为 ９８％， 与双峰驼、 单峰驼相似程度为 ９１％， 与猕猴相似程度为 ９１％， 与马、 驴相似程度为 ８５％， 与人类、 野猪相似程度分别为 ８１％、 ７８％。 Ｍｅｇａ ７􀆰 ０ 分析结果见图 ５， 由图可知水牛与黄牛、 牦牛和美洲 野牛， 以及绵羊最早聚为一类， 同源性较高， 说明 ＣＡＲＴ 基因在多胃反刍动物中保守性较强。 单峰驼与 双峰驼、 野猪、 马与驴各聚为一类， 共 ３ 条分支， 与 牛羊共聚为一大分支， 人类与猕猴聚为一类， 为另一 大分支。 聚类分析可见马与驴分化最早， 最晚为单峰 驼与双峰驼。 畜牧与兽医 ２０２０ 年 第 ５２ 卷 第 ２ 期 ·３·

Animal Husbandry Veterinary Medicine 2020 Vol. 52 No. 2 表2水牛CART基因与11个物种编码区相似性分析 E值/随机匹配可能性与水牛基因匹配一致性/% 参考序列 美洲野牛( Bison bison bison) 7.00E-107 XM010853569.1 野牦牛( Bos mutus) CP027088.1 双峰驼( Camelus bactrianus) 单峰驼( Camelus dromedarii 1.00E-73 XM_o10974976.1 野猪( Sus scrofa) 马( Equus caballus) XM023618226 驴( Equus asinus) XM014851944.1 人类( Homo sapiens) 猕猴( Macaca mulatta) 2.00E-57 NM001265877.1 agr Bison bison bison 2068(NW 011494901.1 g! os mutus2196N07005930741) Camelus bactrianus 2210(NW 011511773.1) Camelus dromedarius 2107(NW 011591039.1) Sus scrofa 2035(NC 010458. 4) 100usa10N004638051 5CART基因系统进化树 2.4水牛CART蛋白理化性质分析 经 Prot Paran在线软件预测显示,水牛CART基因 由116个氨基酸残基组成,分子式为CsHN1s5O3S8 分子量为12790.18,带负电荷的残基总数(Asp+ Gu)为15个,带正电残基总数(Arg+Lys)为17 个,理论p值为8.22,属于碱性蛋白。消光值在 4845~4470之间,不稳定性指数(Ⅱ)计算为 38.67,属于稳定蛋白。 Prot scale在线预测分析显 示,水牛CART蛋白的总平均亲水性为-0.006,属 于两性氨基酸(图6)。 位点 图6水牛CART基因蛋白疏水性分析

表 ２ 水牛 ＣＡＲＴ 基因与 １１ 个物种编码区相似性分析 物种 Ｅ 值／ 随机匹配可能性 与水牛基因匹配一致性／ ％ 参考序列 美洲野牛（Ｂｉｓｏｎ ｂｉｓｏｎ ｂｉｓｏｎ） ７􀆰 ００Ｅ－１０７ １００ ＸＭ＿０１０８５３５６９．１ 野牦牛（Ｂｏｓ ｍｕｔｕｓ） ０ ９８ ＣＰ０２７０８８􀆰 １ 普通牛（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ） ０ １００ ＡＹ６０３９７２􀆰 １ 羊（Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ） ４􀆰 ００Ｅ－９９ ９８ ＸＭ＿０１５１０１１９０􀆰 １ 双峰驼（Ｃａｍｅｌｕｓ ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ） ７􀆰 ００Ｅ－７４ ９１ ＸＭ＿０１０９４９３１３􀆰 １ 单峰驼（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ） １􀆰 ００Ｅ－７３ ９１ ＸＭ＿０１０９７４９７６􀆰 １ 野猪（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ） ０ ７８ ＥＦ５８１８３８􀆰 １ 马（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ） ２􀆰 ００Ｅ－５４ ８５ ＸＭ＿０２３６１８２２６􀆰 １ 驴（Ｅｑｕｕｓ ａｓｉｎｕｓ） １􀆰 ００Ｅ－５３ ８５ ＸＭ＿０１４８５１９４４􀆰 １ 人类（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ） ３􀆰 ００Ｅ－１８０ ８１ ＮＧ＿０１５９８８􀆰 １ 猕猴（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ） ２􀆰 ００Ｅ－５７ ９０ ＮＭ＿００１２６５８７７􀆰 １ 图 ５ ＣＡＲＴ 基因系统进化树 ２􀆰 ４ 水牛 ＣＡＲＴ 蛋白理化性质分析 经 ＰｒｏｔＰａｒａｍ 在线软件预测显示，水牛 ＣＡＲＴ 基因 由 １１６ 个氨基酸残基组成，分子式为 Ｃ５６６Ｈ９４９Ｎ１５５Ｏ１６３ Ｓ８ ， 分子量为 １２ ７９０􀆰 １８， 带负电荷的残基总数 （Ａｓｐ ＋ Ｇｌｕ） 为 １５ 个， 带正电残基总数 （Ａｒｇ ＋Ｌｙｓ） 为 １７ 个， 理论 ｐＩ 值为 ８􀆰 ２２， 属于碱性蛋白。 消光值在 ４ ８４５～ ４ ４７０ 之 间， 不 稳 定 性 指 数 （ Ⅱ） 计 算 为 ３８􀆰 ６７， 属于稳定蛋白。 Ｐｒｏｔ ｓｃａｌｅ 在线预测分析显 示， 水牛 ＣＡＲＴ 蛋白的总平均亲水性为－ ０􀆰 ００６， 属 于两性氨基酸 （图 ６）。 图 ６ 水牛 ＣＡＲＴ 基因蛋白疏水性分析 ·４· Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ＆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０２０ Ｖｏｌ􀆰 ５２ Ｎｏ􀆰 ２

畜牧与兽医2020年第52卷第2期 2.5水牛CART蛋白信号肽及跨膜结构预测分析 2.6水牛CART蛋白二级和三级结构预测及亚细胞 TMHMM2.0预测结果显示,水牛CART蛋白非定位 跨膜蛋白,序列1~30位氨基酸处存在1段N端信号 使用 SOPMA分析显示,水牛CART蛋白二级结 肽,是分泌蛋白(图7) 构主要为α螺旋,无规则卷曲和延伸链,分别占 50.86%、37.93%、10.34%,属于α类蛋白质(图 8)。采用 SWISS-MODEL在线软件预测水牛CART蛋 白三级结构,结果显示该蛋白主要由α-螺旋和无规 则卷曲组成,与二级结构预测结果一致。利用 PSORTⅡ prediction在线软件预测CART蛋白的亚细 胞定位,结果显示该蛋白在在细胞外、线粒体、空 泡、细胞核的分布比例分别为667%、11.1% 跨膜区 膜内区 膜外区 l1.1%、11.1%。 图7水牛CART蛋白跨膜结构预测分析结果 长竖线.α螺旋;中长竖线.延伸链;短竖线.无规则卷曲 图8水牛CART蛋白二级结构预测 2.7蛋白质互作及功能预测 使用 STRING蛋白质互作数据库检索水牛CART 蛋白质序列,检索到该序列与牛可卡因-苯丙胺调解 转录肽前肽( cocaine- and amphetamine- regulated tran- AGRP script peptide concentrations, CARTPT)蛋白质一致, 互作网络结果如下图。由图可见并不能找到有确切证 CDI 据(论文和试验数据)证明与 CARTPT互作的蛋白 CARTPT 质,与之共表达的蛋白有白细胞分化抗原19( cluster of differentiation19,CD19)、神经肽Y( neuropeptide NerSEs Y,NPY)和促肾上腺皮质激素释放激素( corticotro- pin releasing hormone,CRH),其余蛋白质均为文本 关联(图9)。在htp:// kiharalab.og/web/ index.php 网站上进行蛋白质功能预测,预测结果显示,未能预 测出达到置信度的分子功能,找到35条低置信度生 化通路,PFP分数最高的5条为G蛋白偶联受体信 CARTPT:可卡因-苯丙胺调解转录肽前肽;CD19:白细胞分化 号通路、突触传递、细胞饥锇反应、神经冲动传递的抗原19;NPY:神经肽Y;CHH:促肾上腺皮质激素释放激素 正向调节和骨吸收负调节。亚细胞定位预测结果为细 POMC:阿黑皮素原;CCK:胆囊收缩素;LEP:瘦素;AGRP:刺鼠 基因相关蛋白;cR℃3:环状腺嘌呤核糖核苷酸响应蛋白3 胞间隙和分泌泡,与 PSORTⅡ prediction预测结果Nss9:.肿瘤坏死因子受体超家族成员9:MLN:间皮素深色线为 致 共表达,浅色线为基因相邻 图9水牛CART基因蛋白质互作数据库检索结果

２􀆰 ５ 水牛 ＣＡＲＴ 蛋白信号肽及跨膜结构预测分析 ＴＭＨＭＭ ２􀆰 ０ 预测结果显示， 水牛 ＣＡＲＴ 蛋白非 跨膜蛋白， 序列 １～３０ 位氨基酸处存在 １ 段 Ｎ 端信号 肽， 是分泌蛋白 （图 ７）。 图 ７ 水牛 ＣＡＲＴ 蛋白跨膜结构预测分析结果 ２􀆰 ６ 水牛 ＣＡＲＴ 蛋白二级和三级结构预测及亚细胞 定位 使用 ＳＯＰＭＡ 分析显示， 水牛 ＣＡＲＴ 蛋白二级结 构主要为 α 螺旋， 无规则卷曲和延伸链， 分别占 ５０􀆰 ８６％、 ３７􀆰 ９３％、 １０􀆰 ３４％， 属于 α 类蛋白质 （ 图 ８）。 采用 ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ 在线软件预测水牛 ＣＡＲＴ 蛋 白三级结构， 结果显示该蛋白主要由 α－螺旋和无规 则 卷 曲 组 成， 与 二 级 结 构 预 测 结 果 一 致。 利 用 ＰＳＯＲＴ Ⅱ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ 在线软件预测 ＣＡＲＴ 蛋白的亚细 胞定位， 结果显示该蛋白在在细胞外、 线粒体、 空 泡、 细 胞 核 的 分 布 比 例 分 别 为 ６６􀆰 ７％、 １１􀆰 １％、 １１􀆰 １％、 １１􀆰 １％。 长竖线． α 螺旋； 中长竖线． 延伸链； 短竖线． 无规则卷曲 图 ８ 水牛 ＣＡＲＴ 蛋白二级结构预测 ２􀆰 ７ 蛋白质互作及功能预测 使用 ＳＴＲＩＮＧ 蛋白质互作数据库检索水牛 ＣＡＲＴ 蛋白质序列， 检索到该序列与牛可卡因－苯丙胺调解 转录肽前肽 （ｃｏｃａｉｎｅ－ａｎｄ ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｔｒａｎ⁃ ｓｃｒｉｐｔ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ， ＣＡＲＴＰＴ） 蛋白质一致， 互作网络结果如下图。 由图可见并不能找到有确切证 据 （论文和试验数据） 证明与 ＣＡＲＴＰＴ 互作的蛋白 质， 与之共表达的蛋白有白细胞分化抗原 １９ （ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １９， ＣＤ１９）、 神经肽 Ｙ （ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｙ， ＮＰＹ） 和促肾上腺皮质激素释放激素 （ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏ⁃ ｐｉｎ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ， ＣＲＨ）， 其余蛋白质均为文本 关联 （图 ９）。 在 ｈｔｔｐ： ／ ／ ｋｉｈａｒａｌａｂ． ｏｒｇ ／ ｗｅｂ ／ ｉｎｄｅｘ． ｐｈｐ 网站上进行蛋白质功能预测， 预测结果显示， 未能预 测出达到置信度的分子功能， 找到 ３５ 条低置信度生 化通路， ＰＦＰ 分数最高的 ５ 条为 Ｇ 蛋白偶联受体信 号通路、 突触传递、 细胞饥饿反应、 神经冲动传递的 正向调节和骨吸收负调节。 亚细胞定位预测结果为细 胞间隙和分泌泡， 与 ＰＳＯＲＴ Ⅱ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ 预测结果 一致。 ＣＡＲＴＰＴ： 可卡因－苯丙胺调解转录肽前肽； ＣＤ１９： 白细胞分化 抗原 １９； ＮＰＹ： 神 经 肽 Ｙ； ＣＲＨ： 促 肾 上 腺 皮 质 激 素 释 放 激 素； ＰＯＭＣ： 阿黑皮素原； ＣＣＫ： 胆囊收缩素； ＬＥＰ： 瘦素； ＡＧＲＰ： 刺鼠 基因 相 关 蛋 白； ＣＲＴＣ３： 环 状 腺 嘌 呤 核 糖 核 苷 酸 响 应 蛋 白 ３； ＴＮＦＲＳＦ９： 肿瘤坏死因子受体超家族成员 ９； ＭＳＬＮ： 间皮素深色线为 共表达， 浅色线为基因相邻 图 ９ 水牛 ＣＡＲＴ 基因蛋白质互作数据库检索结果 畜牧与兽医 ２０２０ 年 第 ５２ 卷 第 ２ 期 ·５·