引物的设计一般遵循下列原则 1.上游引物与目的DNA5’端序列完全相同; 下游引物与目的DNA3’端序列互补 2.引物长度以15-30个碱基为益; G+C含量为45-55% 3.引物内、引物间不应有互补序列 4.碱基分布随机 5.引物与非特异扩增区的同源性不超过70 第一章6.3端必须互补,5端可游离
第十一章 11 引物的设计一般遵循下列原则： １.上游引物与目的DNA５’端序列完全相同； 下游引物与目的DNA３’端序列互补 ２.引物长度以15-30个碱基为益； G+C含量为45-55％ ３.引物内、引物间不应有互补序列 ４. 碱基分布随机 ５.引物与非特异扩增区的同源性不超过70% 6. 3′端必须互补， 5′端可游离
三、模板的制备 DNA 1从细胞中提取DNA:血细胞、绒毛、尿样、 毛发、精斑、口腔上皮细胞 2.固定和包埋的组织标本:脱蜡、蛋白酶K消 化 RNA 新鲜组织或细胞 所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处 第十一章 理
第十一章 12 三、模板的制备 DNA 1.从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、 毛发、精斑、口腔上皮细胞 2.固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消 化 RNA 新鲜组织或细胞 所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处 理
四、PCR的基本反应 (一)、以DNA为模板的反应: 10x缓冲液 10u 4种dNTP混合物各200μmo 引物 各10~100pmol 模板DNA 0.1~2pg Taq dna聚合酶2.5u 2+ 1.5 mmolL 加双蒸水至 100ul 第十一章
第十一章 13 四、PCR的基本反应 （一）、以DNA为模板的反应： 10×缓冲液 10 l 4种dNTP混合物 各200 mol/L 引物 各10～100 pmol 模板DNA 0.1～2 g Taq DNA聚合酶 2.5 u Mg2+ 1.5 mmol/L 加双蒸水至 100 l
PCR反应五要素:引物、酶、dNTP 模板和Mg2+ Tag dna聚合酶 来自水生栖热菌 Thermusaquaticus 良好的耐热性 Mg2依赖性 无校正功能 第十一章
第十一章 14 PCR反应五要素： 引物、酶、dNTP、 模板和Mg2+ Taq DNA聚合酶 来自水生栖热菌 Thermusaquaticus 良好的耐热性 Mg2+依赖性 无校正功能
()纵mRN为模的反应 mRNA 5 ul 5X Buffer 4 ul dNTP 2μ(10mmo/L RNasin 1ul(20u) 逆转录酶μl(10u) Oligo(dT218(或下游引物)1μl ddo 6ul /20ul 42℃水浴1小时,95℃水浴10分钟灭活 第十一章逆转录酶。向上述反应体系中添加如 下试剂:
第十一章 15 （二）以mRNA为模板的反应 mRNA 5 l 5× Buffer 4 l dNTP 2 l(10mmol/L) RNasin 1 l(20u) 逆转录酶 1 l(10u) Oligo(dT)12-18(或下游引物) 1 l ddH2O 6l /20 l 42℃水浴1小时，95 ℃水浴10分钟灭活 逆转录酶。向上述反应体系中添加如 下试剂：