4重组DNA技术的操作过程 B重组DNA分子的转化和扩增(转与增) 转化的原理与技术 转化率 转化细胞的扩增
B 重组DNA分子的转化和扩增（转与增） 分子的转化和扩增（转与增） 4 重组DNA技术的操作过程 技术的操作过程 转化的原理与技术 转化的原理与技术 转化率率 转化细胞的扩增 转化细胞的扩增
转化的原理与技术 Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化 Ca2诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌(如 大肠杆菌等),1970年建立此技术,其原理是Ca与细菌外 膜磷脂在低温下形成液晶结构,后者经热脉冲发生收缩作用, 使细胞膜出现空隙,细菌细胞此时的状态叫做感受态
转化的原理与技术 转化的原理与技术 Ca Ca2+2+诱导的完整细菌细胞的转化 诱导的完整细菌细胞的转化 Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如 大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外 膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用， 使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态 Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如 大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外 膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用， 使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态
转化的原理与技术 Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化 大肠杆菌感受态细胞的制备: 100m菌体培养至OD600=0.5,离心收集菌体 用10m冰冷的10 mM Cac2溶液悬浮菌体,离心 收集菌体 用1m冰冷的75 mM CaC2溶液悬浮菌体 冰浴放置12-24小时,备用
转化的原理与技术 转化的原理与技术 Ca Ca2+2+诱导的完整细菌细胞的转化 诱导的完整细菌细胞的转化 大肠杆菌感受态细胞的制备： 大肠杆菌感受态细胞的制备： 100 ml 菌体培养至OD600 100 ml 菌体培养至OD600 = 0.5 = 0.5，离心收集菌体 ，离心收集菌体 用10 ml 冰冷的10 mM CaCl 用10 ml 冰冷的10 mM CaCl22溶液悬浮菌体，离心 溶液悬浮菌体，离心 用1 ml 冰冷的75 mM CaCl 用1 ml 冰冷的75 mM CaCl22溶液悬浮菌体 溶液悬浮菌体 冰浴放置 冰浴放置12 - 24 12 - 24小时，备用 小时，备用 收集菌体 收集菌体
转化的原理与技术 Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化 大肠杆菌感受态细胞的质粒转化: ●取100山感受态细胞,加入相当于50ng载体的重组 DNA连接液,混匀 冰浴放置半小时 在42C保温2分钟(热脉冲) 快速将转化细胞转移至冰浴中放置1-2分钟 ●加入1m新鲜培养基,于37C培养1小时(扩增) ●涂在合适的固体培养基平板上进行筛选
转化的原理与技术 转化的原理与技术 Ca Ca2+2+诱导的完整细菌细胞的转化 诱导的完整细菌细胞的转化 大肠杆菌感受态细胞的质粒转化： 大肠杆菌感受态细胞的质粒转化： 取取100 100 µµl l 感受态细胞，加入相当于 感受态细胞，加入相当于50 ng 50 ng 载体的重组 载体的重组 冰浴放置半小时 冰浴放置半小时 在42℃保温 在42℃保温 2 2 分钟（热脉冲） 分钟（热脉冲） 快速将转化细胞转移至冰浴中放置 快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 2 1 - 2分钟分钟 DNA DNA连接液，混匀 连接液，混匀 加入加入1 ml 1 ml 新鲜培养基，于 新鲜培养基，于3737℃培养 ℃培养 1 1 小时（扩增） 小时（扩增） 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选
转化的原理与技术 细菌原生质体的转化 革兰氏阳性细菌(如枯草杄菌、链霉菌等)接纳外源DNA 的主要屏障是细胞壁,因而这类细菌通常采用原生质体(细胞 去壁后的形态)转化的方法转移质粒或重组DNA分子 酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化
转化的原理与技术 转化的原理与技术 细菌原生质体的转化 细菌原生质体的转化 革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA 的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞 去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子 革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA 的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞 去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子 酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化 酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化