人工粘性末端的连接平头末端 5 G 3 3C G TdT dTTP TdT dATP GTTTTTTTTTT 3 CAAAAAAAAAA 3 3 TTTTTTTTTTG 3 AAAAAAAAAAC G 退火 T4-DNA ligase 5 GTTTTTTTTTTG AAAAAAAAAAC CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTG 5 rrrrrryrG AAAAAAAAAAC CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG 加热 AAAA TG AAAA A
人工粘性末端的连接 人工粘性末端的连接 平头末端 C 3' G 5' G 3' G C 5' C 3' G T4-DNA ligase T4-DNA ligase TdT TdT dTTP dTTP TdT TdT dATP dATP GTTTTTTTTTT 3' C 退火退火 C 3' TTTTTTTTTT G CAAAAAAAAAA 3' G G 3' AAAAAAAAAA C 5' 5' GTTTTTTTTTT G CAAAAAAAAAA C CAAAAAAAAAA C GTTTTTTTTTT G S1S1 3' C 5' 5' GTTTTTTTTTT G CAAAAAAAAAA C CAAAAAAAAAA C GTTTTTTTTTT G 加热加热 G T C A T TTTTT T T T G AAAAAAAAA C C A G T AAAAAAAAA C T TTTTT T T T G T G A C C A G T
粘性末端的更换 GGATCC CCTAGG BamHI G 5 GATCC CCTAG 5 G Klenow 补平 5 GGATC 5 GATCC CCTAG 5 CTAGG T4-DNA ligase GGAATTCC CCTTAAGG ECoR I linker EcoR I 5 GGATCGGAATTCCGATCC CCTAGCCTTAAGGCTAGG
粘性末端的更换 粘性末端的更换 BamHI BamHI 5' 5' GGATCC CCTAGG T4-DNA ligase T4-DNA ligase Klenow Klenow 补平补平 5' GATCC 5' G G CCTAG 5' 5' 5' GGATC CCTAG 5' GATCC CTAG G 5' 5' GGATCGGAATTCCGATCC CCTAGCCTTAAGGCTAG G 5' 5' EcoR I EcoR I GGAATTCC CCTTAAGG EcoR I linker EcoR I linker
重组率 重组率的定义 重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数 在常规实验条件下,重组率一般为25-75% 重组率是衡量连接反应效率的重要指标,较高的重组率可以 大大简化DNA重组的后续操作
重组率 重组率的定义组定 重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75% 重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以 大大简化DNA重组的后续操作。 重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75% 重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以 大大简化DNA重组的后续操作
重组率 提高重组率的方法 提高外源DNA片段与载体的分子比:5:1-10:1 载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团: 5 GAAT CTTAAG 碱性磷酸单酯酶 CORI 碱性磷酸单酯酶 G 5 p AATTC G 5 HO AATTC CTTAA OH 5 CTTAA P 5 G 退火 HO OH GA-A-T-T-C C-T-T-A-A G C-T-T-A-A-G HO OH
重组率 提高重组率的方法 提高重组率的方法 提高外源 提高外源DNA DNA片段与载体的分子比： 片段与载体的分子比：5 5 :: 1 - 10 1 - 10 :: 1 1 载体载体DNA DNA分子在连接前先除去磷酸基团： 分子在连接前先除去磷酸基团： 5' 5' GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI EcoRI 5' G CTTAA p AATTC G 5' G 5' p CTTAA OH 5' 5' AATTC G 5' HO 退火退火 5' G-A-A-T-T-C C-T-T-A-A G 5' G A-A-T-T-C C-T-T-A-A-G HO OH HO OH 碱性磷酸单酯酶 碱性磷酸单酯酶 碱性磷酸单酯酶 碱性磷酸单酯酶
重组率 提高重组率的方法 加装同聚尾未端: 5 GCATG 3 CTGCA 3 3 GTACG 5 TdT dCTP dGTP CTGCAGGGGGG 3 3 GGGGGGACGTC 退火 me GCATGCCCCCC CTGCAGGGGGG GGGGGGACGTC CCCCCCGTACG 5 Klenow T4-DNA ligase GCATGCCCCCCTGCAG CTGCAGGGGGGCATGC CGTACGGGGGGACGT GACGTCCCCCCGTACG
重组率 提高重组率的方法 提高重组率的方法 加装同聚尾末端： 加装同聚尾末端： CTGCA 3' G G 3' ACGTC 5' GCATG 3' C 5' C 3' GTACG T4-DNA ligase T4-DNA ligase TdT TdT dCTP dCTP TdT TdT dGTP dGTP GCATGCCCCCC 3' C 退火退火 C 3' CCCCCCGTACG CTGCAGGGGGG 3' G G 3' GGGGGGACGTC 5' 5' GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG 5' 5' GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG Klenow Klenow