操作步骤 ●1.DNA去磷酸化:在 Eppendorf管内加5u DNA, 25ul 50mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)*20ul 碱性磷酸酶,37°℃C反应30~60分钟。然后用酸 变性碱性磷酸酶,用乙醚提取。再加1/1体积 3.0mol醋酸钠,用乙醇沉淀 2将01mCi[y3P]ATP放入小离心管,冻干。 ●3.转32P到DNA上:在含有[y-32P]ATP的小离心 管内,依次加入38μ去磷酸的DNA,10u多杉 苷酸溦酶缓冲液,3μ多核苷酸激酶,在37℃ 反应30~40分钟
l 1. DNA 去磷酸化：在 Eppendorf管内加5μl DNA，25μl 50mmol/L Tris-Cl(pH 8.0）和20μl 碱性磷酸酶，37℃反应30 ~ 60分钟。然后用酸 变性碱性磷酸酶，用乙醚提取。再加 1/10体积 3.0mol/L醋酸钠，用乙醇沉淀。 l 2. 将0.1mCi [γ- 32P]ATP放入小离心管，冻干。 l 3. 转32P到DNA上：在含有 [γ- 32P]ATP的小离心 管内，依次加入38μl去磷酸的DNA，10μl 多核 苷酸激酶缓冲液，3 μl 多核苷酸激酶，在37℃ 反应30 ~ 40分钟
操作步骤 °4.分离:加等体积饱和酚,离心5~10 分钟后,取上清液到另一个小离心管内, 再加500μ乙醚,混匀,离心,弃去上层 含有残留酚溶液,加1/10体积3.0mol/L 醋酸钠。然后加双倍体积冷乙醇混合在 70℃中15分钟,或-20℃中2小时,沉淀 DNA
l 4. 分离：加等体积饱和酚，离心5 ~ 10 分钟后，取上清液到另一个小离心管内， 再加500μl乙醚，混匀，离心，弃去上层 含有残留酚溶液，加 1/10体积 3.0mol/L 醋酸钠。然后加双倍体积冷乙醇混合在- 70℃中15分钟，或-20℃中2小时，沉淀 DNA
(三)随机引物标记法 L原理] ●随机引物是指含有各种可能排列组合顺序的寡 核苷酸混合物。目前实验室中常用的随机引物 多是人工合成,其长度为6个核苷酸。标记的 方法是将双链DNA变性成单链DNA,再与随机 引物退火杂交,在四种脱氧三磷酸核苷存在下, 由大DNA聚合酶大片段( Klenow片段)催化 从引物的3′末端开始按5′→3方向合成与模板 DNA互补的DNA链,如有[(-3P]dNTP或其他 示踪物的掺人,就可产生标记的DNA探针
l ［原理］ l 随机引物是指含有各种可能排列组合顺序的寡 核苷酸混合物。目前实验室中常用的随机引物 多是人工合成，其长度为6个核苷酸。标记的 方法是将双链DNA变性成单链DNA，再与随机 引物退火杂交，在四种脱氧三磷酸核苷存在下， 由大DNA聚合酶大片段（Klenow片段）催化， 从引物的3′末端开始按5′→3′方向合成与模板 DNA互补的DNA链，如有[α- 32P]dNTP或其他 示踪物的掺人，就可产生标记的DNA探针
原理] ●随机引物是指含有各种可能排列组合顺序的寡 核苷酸混合物。目前实验室中常用的随机引物 多是人工合成,其长度为6个核苷酸。标记的 方法是将双链DNA变性成单链DNA,再与随机 引物退火杂交,在四种脱氧三磷酸核苷存在下 由大DNA聚合酶大片段( Klenow片段)催化, 从引物的3′末端开始按5′→3方向合成与模板 DNA互补的DNA链,如有[(-32P]dNTP或其他 示踪物的掺人,就可产生标记的DNA探针
l 随机引物是指含有各种可能排列组合顺序的寡 核苷酸混合物。目前实验室中常用的随机引物 多是人工合成，其长度为6个核苷酸。标记的 方法是将双链DNA变性成单链DNA，再与随机 引物退火杂交，在四种脱氧三磷酸核苷存在下， 由大DNA聚合酶大片段（Klenow片段）催化， 从引物的3′末端开始按5′→3′方向合成与模板 DNA互补的DNA链，如有[α- 32P]dNTP或其他 示踪物的掺人，就可产生标记的DNA探针
操作步骤 1.在 Eppendorf管中,将TE溶解的 30~100ng纯化的双链DNA与1~5ng随机 引物混合(总体积不超过14μ),置沸水 中变性3分钟,再立即置冰浴中冷却 ●2.迅速离心10秒,使溶液聚集于试管底 部,冰浴中放置;
l 1 . 在E p p e n d o rf管中，将T E溶解的 30~100ng 纯化的双链DNA与1 ~ 5ng随机 引物混合（总体积不超过14μl），置沸水 中变性3分钟，再立即置冰浴中冷却； l 2. 迅速离心10秒，使溶液聚集于试管底 部，冰浴中放置；