操作步骤 1.加样:冰浴下依次加入下列试剂并混匀: ●10×缺口平移缓冲液 2. 5ul 未标记的dNTP混合液 1.Oul DNA(0.5-lug) 50u Ja-32PI dATP 50u ● DNaseⅠ(振荡混匀) ●DNA聚合酶Ⅰ(振荡混匀) 0.5u ●双蒸去离子水至体积 25u
l 1. 加样：冰浴下依次加入下列试剂并混匀： l 10×缺口平移缓冲液 2.5μl l 未标记的 dNTP混合液 1.0μl l DNA（0.5~1μg) 5.0μl l [α- 32P] dATP 5.0μl l DNaseⅠ（振荡混匀） 2.5μl l DNA聚合酶Ⅰ（振荡混匀） 0.5μl l 双蒸去离子水至体积 25μl
操作步骤 2.反应:于14~16℃水浴2~3小时。加1ul 0.5 MOl/L EDTA(pH8.0)终止反应 ●3.分离:标记完毕的反应液加至TE缓冲液平衡 的 Sephadex g-50柱上(柱床体积为 0.7×30mm)。加样完毕后,用TE缓冲液洗脱, 分管收集洗脱液,每管约200山l。再每管取5μl 点样于滤纸上液闪计数。主峰为纯化的标记探 针,尾峰为未被结合的游离标记核苷酸。将主 峰部分收集,—20°℃储存
l 2. 反应：于14 ~ 16℃水浴2~3小时。加1μl 0 .5mol/L EDTA（pH8.0)终止反应。 l 3. 分离：标记完毕的反应液加至TE缓冲液平衡 的 S e p h a d e x G - 5 0 柱 上 （ 柱 床 体 积 为 0.7×30mm）。加样完毕后，用TE缓冲液洗脱， 分管收集洗脱液，每管约200μl。再每管取5 μl 点样于滤纸上液闪计数。主峰为纯化的标记探 针，尾峰为未被结合的游离标记核苷酸。将主 峰部分收集，—20℃储存。 l
操作步骤 4.结合率的计算: 主峰计数(CPM) ●结合率 X100 主峰计数(CPM)+尾峰计数(CPM) ●一般结合率在20~30
l 4. 结合率的计算： l l 主峰计数（CPM） l 结合率= x 100% l 主峰计数（CPM）+尾峰计数（CPM） l l 一般结合率在20 ~ 30%
(二)5末端标记法 ●[原理] ●DNA5′末端的磷酸根,用碱性磷酸酶去磷酸化, 再用T4多核苷酸溦酶将[γ-3P]ATP的y-32P转移 到DNA5端的羟基上
l ［原理］ l DNA 5′末端的磷酸根，用碱性磷酸酶去磷酸化， 再用T4多核苷酸激酶将[ γ- 32P ]ATP的γ- 32P转移 到 DNA 5′端的羟基上
L试剂] ●1.5×T4多核苷酸激酶缓冲液 0.5mol/L Tris-Cl(pH 7.6) ●0.lmol/MgC2 50mmol/L DTT ●1mmol/L精脒( Spermidine) ●2.T4多核苷酸激酶溶液(1U/μd) ●3.碱性磷酸酶(2~5U/ml
l 1. 5×T4多核苷酸激酶缓冲液 l 0.5mol/L Tris-Cl(pH 7.6） l 0.1mol/L MgCl2 l 50mmol/L DTT l 1 mmol/L 精脒（Spermidine） l 2. T4多核苷酸激酶溶液（1U/μl） l 3. 碱性磷酸酶（2 ~ 5U/ml）