湖北医药学院&北京协和医院：TCRγ9/δ2(OT3)-Fc融合蛋白体内抗肿瘤效果研究.doc

TCRy962(OT3)Fc融合蛋白体内抗肿瘤效果研究郭阳12郑静2胡愉2崔莲仙2何维2 (湖北医药学院基础医学院免疫教研室湖北十堰442000 2北京协和医学院基础学院中国医学科学院基础医学研究所免疫学系北京100005) 「摘要]目的:研究TCR962(OT3)Fc融合蛋白在体内抗肿瘤效果。方法:通过同位素标记技术观察TCRγ9/62(0I3}Fc在荷瘤裸鼠体内的显像和分布, 及观察TCRγ9δ2(OT3)-Fc对荷瘤裸鼠肿瘤生长和生存期的影响。结果:在荷瘤裸鼠体内∞I-TCRγ962(O3)-Fc与肿瘤组织有明显的结合,并且其可抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长速度,延长小鼠生存期。结论:本研究初步证明TCRγ9/62(OT3)Fc 在荷瘤裸鼠体内有一定的抗肿瘤效果,为肿瘤靶向性抗体治疗提供了新的思路关键词]TCRγ962(OT3}Fc;肿瘤靶向治疗;荷瘤裸鼠 Anti-tumor Effect ofTCry 9/82(OT3)-Fc in Nude Mice Bearing Tumor GUO Yang 2, ZHENG Jing2, HU Yu2, CUI Lian-xian HE Wei? A School of Basic Medicine, Hubei University of Medicine, Shiyan, Hubei 442000; Department o Immunology, BMS& School of Basic Medicine, CAMS PUMC, Beijing 100005, China Abstract: Objective To investigate the anti-tumor effects of TCry9/82(OT3)-Fc fusion protein in vivo. Methods We observed the imaging and distribution of TCRy9/82(OT3-Fc in nude mice bearing tumor through labeling 99mTc. Meanwhile we observed the tumor growth and survival of nude mice with the treatment of TCRy 9/82(OT3)-Fc. Results In nude mice 9gmTc-TCRy 9/2(OT3)-Fc showed obvious binding ability with tumor tissue and it inhibited tumor growth in nude mice and prolong surv ival of mice. Conclusion Our preliminary study demonstrated the anti-tumor effect of TCry 9/02(OT3)-Fc in nude mice bearing tumor and provide a novel strategy for tumor targeting antibody therapy Key words: TCRy 9/62(OT3)-Fc, tumor targeting therapy; nude mice bearing tumor [基金项目]国家高技术研究发展计划(863计划)(2006AA02A245) [作者简介]郭阳(1979-),女,湖北文安人,讲师,博士,研究方向:肿瘤免疫学 [通信作者]何维(1955-),男,黑龙江呼兰人,教授,博士生导师,研究方向:肿瘤免疫学。E-mail:heweiimu@public.bta.net.cn

[基金项目] 国家高技术研究发展计划(863 计划)（2006AA02A245） [作者简介] 郭阳（1979-），女，湖北文安人，讲师，博士，研究方向：肿瘤免疫学。 [通信作者] 何维（1955-），男，黑龙江呼兰人，教授，博士生导师，研究方向：肿瘤免疫学。E-mail:heweiimu@public.bta.net.cn TCR9/2(OT3)-Fc 融合蛋白体内抗肿瘤效果研究郭阳 1,2 郑静 2 胡愉 2 崔莲仙 2 何维 2，（1 湖北医药学院基础医学院免疫教研室湖北十堰 442000； 2 北京协和医学院基础学院中国医学科学院基础医学研究所免疫学系北京 100005） [摘要]目的：研究 TCR9/2(OT3)-Fc 融合蛋白在体内抗肿瘤效果。方法：通过同位素 99mTc 标记技术观察 TCR9/2(OT3)-Fc 在荷瘤裸鼠体内的显像和分布，及观察 TCR9/2(OT3)-Fc 对荷瘤裸鼠肿瘤生长和生存期的影响。结果：在荷瘤裸鼠体内 99mTc-TCRγ9/δ2(OT3)-Fc 与肿瘤组织有明显的结合，并且其可抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长速度，延长小鼠生存期。结论：本研究初步证明 TCR9/2(OT3)-Fc 在荷瘤裸鼠体内有一定的抗肿瘤效果，为肿瘤靶向性抗体治疗提供了新的思路。 [关键词] TCR9/2(OT3)-Fc；肿瘤靶向治疗；荷瘤裸鼠 Anti-tumorEffect of TCR9/2(OT3)-Fc in Nude Mice Bearing Tumor GUO Yang1,2, ZHENG Jing2, HU Yu2 , CUI Lian-xian2 , HE Wei2 ( 1 School of Basic Medicine,Hubei University of Medicine,Shiyan,Hubei 442000; 2Department of Immunology,IBMS& School of Basic Medicine,CAMS & PUMC,Beijing 100005,China) Abstract: Objective To investigate the anti-tumor effects of TCR9/2(OT3)-Fc fusion protein in vivo. Methods We observed the imaging and distribution of TCR9/2(OT3)-Fc in nude mice bearing tumor through labeling 99mTc. Meanwhile, we observed the tumor growth and survival of nude mice with the treatment of TCR9/2(OT3)-Fc. Results In nude mice 99mTc-TCR9/2(OT3)-Fc showed obvious binding ability with tumor tissue and it inhibited tumor growth in nude mice and prolong survival of mice. Conclusion Our preliminary study demonstrated the anti-tumor effect of TCR9/2(OT3)-Fc in nude mice bearing tumor and provide a novel strategy for tumor targeting antibody therapy. Key words: TCR9/2(OT3)-Fc; tumor targeting therapy; nude mice bearing tumor

γδT细胞是免疫系统中的一个独特的群体,在外周淋巴细胞库中是数量较小的亚群,约占正常人外周血CD3T淋巴细胞总数的1%~10%。y6T细胞被视为处于免疫防御系统的第一线,在抗感染和抗肿瘤过程中起到重要的防御作用凹。近年来γ6T细胞在肿瘤免疫中的积极作用备受关注。在体内外的实验表明,y6T 细胞对不同性质的多种肿瘤细胞,如黑色素瘤、淋巴瘤凹]、卵巢癌和肺癌刂等均具有良好的细胞毒作用。TCRy6与 TCRab不同,其识别抗原不具有MHC分子的限制性,可以直接识别肿瘤细胞抗原凹。为此,我们建立了一个构建新型抗肿瘤抗体的新策略一将人类TCRγ6识别肿瘤的特性通过基因工程的方法移植到一个基因工程抗体中,这样将γ6T细胞和抗体二者的优点集于一身,从而形成一种新型完全人源化的抗肿瘤抗体。TCRγδ识别肿瘤抗原的主要结构域是CDR3δ,本项目前期发现了卵巢上皮癌组织浸润的γ6T细胞TCR的一个CDR3δ的基因优势序列(OT3)l5,因此我们利用昆虫表达系统表达了TCR962(OT3}Fc融合蛋白, 既保留完整TCR6识别肿瘤抗原的特点,又兼有抗体的Fc片段。本研究主要通过同位素标记技术观察TCRγ962(OT3)-Fc在荷瘤裸鼠体内的显像和分布,及 TCRγ962(OT3}Fc融合蛋白在荷瘤裸鼠体内的治疗效果,从而初步研究 ICRγ9/62(0OT3}Fc在体内的抗肿瘤效果。 1材料和方法 1实验动物 BALB裸鼠,4~6周,雌性,均购自中国药品和生物制品检定所啮齿类实验动物中心。饲养于中国医学科学院基础医学研究所动物中心二级动物房 12细胞株 SKOV3,人类卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株,以含10%FCS的 DMEM-F12 培养基进行贴壁培养 13主要试剂和仪器 SnCl,无水乙醇,葡庚糖酸钠(GH),2-亚氨基噻吩(2-I)均为AR,Si 公司产品,C-18纯化柱( Sigma公司产品),Na9mcO4(北京原子高科奶站)。淋巴细胞分离液(天津瀚洋生物有限公司,中国)。ck-8(同仁化学,日本)。 LKBy计数器(瑞典), ICON SPECT(西门子,德国),R905活度计(中国计量科学研究院),HP100, Zorbax SB-C18 column,EG& E Radioflow Dectector LB509

 T 细胞是免疫系统中的一个独特的群体，在外周淋巴细胞库中是数量较小的亚群，约占正常人外周血 CD3+ T 淋巴细胞总数的 1%～10%。 T 细胞被视为处于免疫防御系统的第一线，在抗感染和抗肿瘤过程中起到重要的防御作用[1]。近年来  细胞在肿瘤免疫中的积极作用备受关注。在体内外的实验表明，  细胞对不同性质的多种肿瘤细胞，如黑色素瘤、淋巴瘤、卵巢癌和肺癌等均具有良好的细胞毒作用。TCR与 TCRab 不同，其识别抗原不具有 MHC 分子的限制性，可以直接识别肿瘤细胞抗原[4]。为此，我们建立了一个构建新型抗肿瘤抗体的新策略－将人类 TCR识别肿瘤的特性通过基因工程的方法移植到一个基因工程抗体中，这样将  细胞和抗体二者的优点集于一身，从而形成一种新型完全人源化的抗肿瘤抗体。TCR识别肿瘤抗原的主要结构域是 CDR3δ，本项目前期发现了卵巢上皮癌组织浸润的 γδT细胞 TCR 的一个 CDR3δ 的基因优势序列（OT3）[5]，因此我们利用昆虫表达系统表达了 TCR9/2(OT3)-Fc 融合蛋白，既保留完整 TCR识别肿瘤抗原的特点，又兼有抗体的 Fc 片段。本研究主要通过同位素标记技术观察 TCR9/2(OT3)-Fc 在荷瘤裸鼠体内的显像和分布，及 TCR9/2(OT3)-Fc 融合蛋白在荷瘤裸鼠体内的治疗效果，从而初步研究 TCR9/2(OT3)-Fc 在体内的抗肿瘤效果。 1 材料和方法 1.1 实验动物 BALB/c 裸鼠，4～6 周，雌性，均购自中国药品和生物制品检定所啮齿类实验动物中心。饲养于中国医学科学院基础医学研究所动物中心二级动物房。 1.2 细胞株 SKOV3，人类卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株，以含 10%FCS 的 DMEM-F12 培养基进行贴壁培养。 1.3 主要试剂和仪器 SnCl2，无水乙醇，葡庚糖酸钠（GH），2-亚氨基噻吩（2-IT）均为 A.R，Sigma 公司产品，C-18 纯化柱（Sigma 公司产品），Na99mTcO4（北京原子高科奶站）。淋巴细胞分离液（天津瀚洋生物有限公司，中国）。cck-8（同仁化学，日本）。 LKB γ 计数器（瑞典），ICON SPECT（西门子，德国），R-905 活度计（中国计量科学研究院），HP 1100，Zorbax SB-C18 column, EG&E Radioflow Dectector LB509

14实验方法肿瘤反应性TCR?962(OT3)-Fc融合蛋白的表达:利用昆虫表达系统表达 TCR9/62(OT3)Fc融合蛋白,实验方法见本研究前期发表文章6。荷瘤裸鼠模型的建立:取新鲜传代培养的人卵巢癌细胞SKOV3,用0.25% 的胰酶消化,用PBS清洗3变,重悬,计数;给裸鼠右前腋下接种1×106/只人卵巢癌细胞SKOV3,标准饲养,约14d肿瘤长至约0.5cm3,进行下步实验。 TCRγ9/62(OT3)}Fc在荷人卵巢癌(SKOV3)裸鼠体内显像实验:取0.5mg 抗体TCR?9/62(OT3)Fc,加入50μL的2mg/mL2IT,避光,室温反应45min 过PD-10柱纯化:修饰后融合蛋白TCRγ9/62(OT3)Fc加入10μ100mgmL葡庚糖酸纳溶液和8μ的1 mg/mL SnCl2溶液,立即加入0.2mL2.lmCi的mTe, 室温反应15min后过PD-10柱纯化分离,收集标记产品,测定放射性计数并计算标记率和产率。收集2.5mL产品,放射性活度1.7mCi。尾静脉注射标记的融合蛋白02mL(024mCi),分别于于注射后10min、3h、7h和24h进行显像采集计数为500k,采集炬阵为128×128,ZOOM为3.67,能峰为140keV,能窗20%,使用低能髙分辨平行孔准直器。观察标记药物在裸鼠体内的显像情况 TCRγ9/62(OT3)Fcc的在荷人卵巢癌(SKOV3)裸鼠体内分布实验:给每只裸鼠前腋下接种1×106人卵巢癌细胞SKOⅤ3细胞,标准饲养。当肿瘤长至约 07cm时,平均分成2组,每组3只,其中两组尾静脉注射 9mc-TCR?9/62(OT3}Fc,体积0.1mL(1.85MBq,含抗体约25μg)分别于用药后4h和24h,从眼球取血,扭断颈椎至死,解剖,取心、肝、脾、肾、肺、胃、畅、肌肉、骨和肿瘤等主要脏器,称重,并测定放射性计数,计算每克组织摄取放射性的百分比(ID%g)和肿瘤/非肿瘤组织放射性(TNT)的比值。 TCRγ9)62(O3}Fc融合蛋白的荷瘤(SKoⅴ3)裸鼠治疗实验:荷瘤裸鼠模型的建立:方法同前。肿瘤大小为0.1cm3时,将裸鼠随机分为2组:PBS对照组和治疗组。每次治疗剂量:PBS对照组40μPBS只;抗体治疗组每只荷瘤裸鼠与肿瘤周边注射40μL,浓度为1uguL(即40g/只)TR?9/62(OT3)Fc。第一次注射记为第1天,每3d治疗一次,共治疗4次。从第1天起每3d观察肿瘤结节生长情况。用卡尺测量肿瘤结节的长径与短径,计算肿瘤体积。瘤体体积计算公式:瘤体体积(mm3)=a×b2×0.5。a:瘤体长径(mm),b:瘤体短径(mm)。并观察各组小鼠的生存期

1.4 实验方法肿瘤反应性 TCR9/2(OT3)-Fc 融合蛋白的表达：利用昆虫表达系统表达 TCR9/2(OT3)-Fc 融合蛋白，实验方法见本研究前期发表文章[6]。荷瘤裸鼠模型的建立：取新鲜传代培养的人卵巢癌细胞 SKOV3，用 0.25% 的胰酶消化，用 PBS 清洗 3 变，重悬，计数；给裸鼠右前腋下接种 1×106 /只人卵巢癌细胞 SKOV3，标准饲养，约 14 d 肿瘤长至约 0.5 cm3，进行下步实验。 TCR9/2(OT3)-Fc 在荷人卵巢癌（SKOV3）裸鼠体内显像实验：取 0.5 mg 抗体 TCR9/2(OT3)-Fc，加入 5.0 L 的 2mg/mL 2-IT，避光，室温反应 45 min，过 PD-10 柱纯化；修饰后融合蛋白 TCR9/2(OT3)-Fc 加入 10 L 100 mg/mL 葡庚糖酸纳溶液和 8 L 的 1 mg/mL SnCl2 溶液，立即加入 0.2 mL 2.1mCi 的 99mTc，室温反应 15 min 后过 PD-10 柱纯化分离，收集标记产品，测定放射性计数并计算标记率和产率。收集 2.5 mL 产品，放射性活度 1.7 mCi。尾静脉注射标记的融合蛋白 0.2 mL（0.24mCi）,分别于于注射后 10 min、3 h、7 h 和 24 h 进行显像。采集计数为 500k，采集炬阵为 128×128，ZOOM 为 3.67，能峰为 140 keV，能窗 20%，使用低能高分辨平行孔准直器。观察标记药物在裸鼠体内的显像情况。 TCR9/2(OT3)-Fc c 的在荷人卵巢癌（SKOV3）裸鼠体内分布实验：给每只裸鼠前腋下接种 1×106 人卵巢癌细胞 SKOV3 细胞，标准饲养。当肿瘤长至约 0.7 cm 时，平均分成 2 组，每组 3 只，其中两组尾静脉注射 99mTc-TCR9/2(OT3)-Fc，体积 0.1 mL（1.85 MBq，含抗体约 2.5μg）分别于用药后 4 h 和 24 h，从眼球取血，扭断颈椎至死，解剖，取心、肝、脾、肾、肺、胃、畅、肌肉、骨和肿瘤等主要脏器，称重，并测定放射性计数，计算每克组织摄取放射性的百分比（ID%/g）和肿瘤/非肿瘤组织放射性（T/NT）的比值。 TCR9/2(OT3)-Fc 融合蛋白的荷瘤（SKOV3）裸鼠治疗实验：荷瘤裸鼠模型的建立：方法同前。肿瘤大小为 0.1 cm3 时，将裸鼠随机分为 2 组：PBS 对照组和治疗组。每次治疗剂量：PBS 对照组 40 L PBS/只；抗体治疗组每只荷瘤裸鼠与肿瘤周边注射 40 L，浓度为 1 g/L（即 40 g/只）TCR9/2(OT3)-Fc。第一次注射记为第 1 天，每 3 d 治疗一次，共治疗 4 次。从第 1 天起每 3 d 观察肿瘤结节生长情况。用卡尺测量肿瘤结节的长径与短径，计算肿瘤体积。瘤体体积计算公式：瘤体体积（mm3）=a  b 2  0.5。a：瘤体长径（mm），b：瘤体短径（mm）。并观察各组小鼠的生存期