《病毒学报》（山东大学）：基于生活污水监测的诺如病毒分子流行病学研究

病毒学报 病毒学报 Chinese ournal of virology 2切Ss1008CN11!65/R 《病毒学报》网络首发论文 题目 基于生活污水监测的诺如病毒分子流行病学研究 作者 刘姗姗,陶泽新,王素婷,周楠,林小娟,宋艳艳,徐爱强 DOI 10. 13242/j cnki. bingduxuebao. 003356 收稿日期 2018-01-16 网络首发日期:2018-0408 引用格式: 刘姗姗,陶泽新,王素婷,周楠,林小娟,宋艳艳,徐爱强.基于生活污水 监测的诺如病毒分子流行病学研究.病毒学报 https://doi.org/10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003356 n*知 网络首发:在编辑部工作流程中,稿件从录用到出版要经历录用定稿、排版定稿、整期汇编定稿等阶 段。录用定稿指内容已经确定,且通过同行评议、主编终审同意刊用的稿件。排版定稿指录用定稿按照期 刊特定版式(包括网络呈现版式)排版后的稿件,可暂不确定出版年、卷、期和页码。整期汇编定稿指出 版年、卷、期、页码均已确定的印刷或数字出版的整期汇编稿件。录用定稿网络首发稿件内容必须符合《出 版管理条例》和《期刊出版管理规定》的有关规定:学术研究成果具有创新性、科学性和先进性,符合编 辑部对刊文的录用要求,不存在学术不端行为及其他侵权行为:稿件内容应基本符合国家有关书刊编辑 出版的技术标准,正确使用和统一规范语言文字、符号、数字、外文字母、法定计量单位及地图标注等 为确保录用定稿网络首发的严肃性,录用定稿一经发布,不得修改论文题目、作者、机构名称和学术内容, 只可基于编辑规范进行少量文字的修改 出版确认:纸质期刊编辑部通过与《中国学术期刊(光盘版)》电子杂志社有限公司签约,在《中国 学术期刊(网络版)》出版传播平台上创办与纸质期刊内容一致的网络版,以单篇或整期出版形式,在印刷 出版之前刊发论文的录用定稿、排版定稿、整期汇编定稿。因为《中国学术期刊(网络版)》是国家新闻出 版广电总局批准的网络连续型出版物(ISSN2096-4188,CN116037/Z),所以签约期刊的网络版上网络首 发论文视为正式出版

病毒学报 Chinese Journal of Virology ISSN 1000-8721,CN 11-1865/R 《病毒学报》网络首发论文 题目： 基于生活污水监测的诺如病毒分子流行病学研究 作者： 刘姗姗，陶泽新，王素婷，周楠，林小娟，宋艳艳，徐爱强 DOI： 10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003356 收稿日期： 2018-01-16 网络首发日期： 2018-04-08 引用格式： 刘姗姗，陶泽新，王素婷，周楠，林小娟，宋艳艳，徐爱强．基于生活污水 监测的诺如病毒分子流行病学研究．病毒学报. https://doi.org/10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003356 网络首发：在编辑部工作流程中，稿件从录用到出版要经历录用定稿、排版定稿、整期汇编定稿等阶 段。录用定稿指内容已经确定，且通过同行评议、主编终审同意刊用的稿件。排版定稿指录用定稿按照期 刊特定版式（包括网络呈现版式）排版后的稿件，可暂不确定出版年、卷、期和页码。整期汇编定稿指出 版年、卷、期、页码均已确定的印刷或数字出版的整期汇编稿件。录用定稿网络首发稿件内容必须符合《出 版管理条例》和《期刊出版管理规定》的有关规定；学术研究成果具有创新性、科学性和先进性，符合编 辑部对刊文的录用要求，不存在学术不端行为及其他侵权行为；稿件内容应基本符合国家有关书刊编辑、 出版的技术标准，正确使用和统一规范语言文字、符号、数字、外文字母、法定计量单位及地图标注等。 为确保录用定稿网络首发的严肃性，录用定稿一经发布，不得修改论文题目、作者、机构名称和学术内容， 只可基于编辑规范进行少量文字的修改。 出版确认：纸质期刊编辑部通过与《中国学术期刊（光盘版）》电子杂志社有限公司签约，在《中国 学术期刊（网络版）》出版传播平台上创办与纸质期刊内容一致的网络版，以单篇或整期出版形式，在印刷 出版之前刊发论文的录用定稿、排版定稿、整期汇编定稿。因为《中国学术期刊（网络版）》是国家新闻出 版广电总局批准的网络连续型出版物（ISSN 2096-4188，CN 11-6037/Z），所以签约期刊的网络版上网络首 发论文视为正式出版

DOl:10.13242/ cnki. bingduxuebao.003356网络首发时间:2018-04-081323:00 网络首发地址:http://kns.cnki.net/kcms/detai/11.1865.r.20180406.1825.008.html 病毒学报 CHINESE JOURNAL OF VIROLOGY 基于生活污水监测的诺如病毒分子流行病学研究 刘姗姗',陶泽新ξ,王素婷ξ,周楠',林小娟2,宋艳艳,徐爱强 1,2 (1.山东大学公共卫生学院,济南250012;2.山东省疾病预防控制中心山东大学预防医学研究院山东省传染病 预防控制重点实验室,济南250014) 摘要:为了解生活污水中诺如病毒( norovirus,NoV)检出情况、基因型分布和分子流行病学特征,进一步探索环境 监测技术用于研究病毒性胃肠炎病原区域性流行的必要性,本研究于2016年1~12月在山东省济南和临沂两地采 集生活污水,通过阴离子膜吸附洗脱法对收集到的24份污水样品进行浓缩后,提取核酸,经过逆转录一聚合酶链反 应扩增 NoV VP1基因片段,经TA克隆后测序,进行分型和系统进化树分析。结果显示,监测地区生活污水标本中 GI的检出率为100%,GⅡ为95.8%。共获得412条NoV序列,分别属于6个Gl基因型和8个GⅡl基因型,其中Gl (32.3%,133/412)、GI.3(14.1%,58/412)和G.17(25.7%,106/412)检出数量最多。G.17检出序列均属于Ka masaki3o8变异株,而前些年大流行的G4的检出序列占比仅1.0%,属于 Sydney2012变异株。本研究描述了 2016年山东省本地流行的诺如病毒基因型分布和序列特征,证明了可以通过对城市污水进行监测来探索人群中循 环的诺如病毒的遗传多样性 关键词:诺如病毒;急性胃肠炎;分子流行病学;环境监测 中图分类号:R373.2文献标识码:A 诺如病毒( Norovirus,NoV),属于人类杯状病系统报告,在2012~2016年间我国24个省96个城 毒科( Human calicivirus,HuCV)诺如病毒属,于市共发生313次由NoV引起的暴发事件,其中2016 1972年通过免疫电镜技术首次在美国俄亥俄州诺年NoV暴发109次。由于NoV无症状携带者和 瓦克地区暴发的流行性腹泻疫情中发现,是首个被不选择就医的轻症患者较多,所以临床病例的监测 确认的引起人类急性胃肠炎的病毒口。NoV基因组数据不能完全反映病原真正的流行病学特征,生活 为单股正链RNA,全长约75kb,分为三个开放阅污水中检测到的NoV序列和人群中胃肠炎病例的 读框架( Open Reading Frames,ORFs),ORF1编码NoV序列密切相关。鉴于此本研究在2016年对 非结构蛋白,ORF2和ORF3分别编码主要衣壳蛋山东省济南和临沂两地城市污水中的NoV进行了 白VP1和次要结构蛋白VP2。根据VP1蛋白编码监测分析,获取监测地区NoV分子流行病学及其系 的序列不同可分为7个基因群(GI~GV),其中GI、统进化特征,以探索胃肠炎病毒环境监测的重要 G和GⅣV可感染人类。 性,并为当地NoV胃肠炎的防控提供科学依据。 NoV是引起人类急性胃肠炎的主要原因之 可导致散发或暴发。在全球范围内,约五分之一的 材料与方法 腹泻病例由NoV引起四。NoV所致胃肠炎虽然属 于自限性疾病,但可导致婴儿和老年人产生严重的 1污水的采集与浓缩 症状甚至死亡。国家突发公共卫生事件信息管理 本研究以山东省济南和临沂两地为监测点,于 2016年1~12月每月中旬分别采集两地污水处理厂 收稿日期:201801-16;修回日期:2018-02-25 进水口处的污水标本1L,所采水样低温运输至实 基金项目:泰山学者工程专项经费资助(ts.20151105);国家自验室4℃保存,于24小时内采用阴离子膜吸附洗脱 然科学基金项目(81573209).题目:环境污水中人类胃肠炎病毒的法对采集的污水进行100倍的浓缩,最终浓缩液 型别多样性、遗传进化规律及其与人群疾病发生的关系;山东省自 然科学基金项目(ZR2014HM076),题目:基于环境污水监测的诺如体积为10ml,置于-80℃冻存。 病毒基因型分布和分子流行病学研究 2病毒RNA的提取 作者简介 姗(1993-),女,湖北省襄阳市人,硕士研究生 使用美国 QIAGEN公司的 QIAamp Viral 主要从事诺如病毒方面的研究,E-mail:shanshanyou@foxmail.com ,通讯作者:宋艳艳(1963-),副教授,T61:0531-88625. RNA MIni Kit试剂盒,根据使用说明操作,从140μl E-mail: yysong(a sdu. edu. cn;徐爱强(1963-),主任医师,T 污水浓缩液中提取总RNA,加入11l(40U)RNa 0531-82679606.e-mail:aqxuepi(@163.com sin,置于-80℃冻存

病 毒 学 报 CHINESE JOURNAL OF VIROLOGY 基于生活污水监测的诺如病毒分子流行病学研究 刘姗姗 1 ，陶泽新 2 ，王素婷 2 ，周楠 1 ，林小娟 2 ，宋艳艳 1* ，徐爱强 1，2* （1.山东大学 公共卫生学院，济南 250012； 2.山东省疾病预防控制中心 山东大学预防医学研究院 山东省传染病 预防控制重点实验室，济南 250014） 摘要：为了解生活污水中诺如病毒（Norovirus，NoV）检出情况、基因型分布和分子流行病学特征，进一步探索环境 监测技术用于研究病毒性胃肠炎病原区域性流行的必要性，本研究于 2016 年 1~12 月在山东省济南和临沂两地采 集生活污水，通过阴离子膜吸附洗脱法对收集到的 24 份污水样品进行浓缩后，提取核酸，经过逆转录-聚合酶链反 应扩增 NoV VP1 基因片段，经 TA 克隆后测序，进行分型和系统进化树分析。结果显示，监测地区生活污水标本中 GI 的检出率为 100%，GII 为 95.8%。共获得 412 条 NoV 序列，分别属于 6 个 GI 基因型和 8 个 GII 基因型，其中 GI.6 （32.3%，133/412）、GII.3（14.1%，58/412）和 GII.17（25.7%，106/412）检出数量最多。GII.17 检出序列均属于 Ka⁃ wasaki 308 变异株，而前些年大流行的 GII.4 的检出序列占比仅 1.0%，属于 Sydney 2012 变异株。本研究描述了 2016 年山东省本地流行的诺如病毒基因型分布和序列特征，证明了可以通过对城市污水进行监测来探索人群中循 环的诺如病毒的遗传多样性。 关键词：诺如病毒；急性胃肠炎；分子流行病学；环境监测 中图分类号：R373.2 文献标识码：A 诺如病毒（Norovirus，NoV），属于人类杯状病 毒 科（Human Calicivirus，HuCV）诺 如 病 毒 属 ，于 1972 年通过免疫电镜技术首次在美国俄亥俄州诺 瓦克地区暴发的流行性腹泻疫情中发现，是首个被 确认的引起人类急性胃肠炎的病毒［1］ 。NoV 基因组 为单股正链 RNA，全长约 7.5 kb，分为三个开放阅 读框架（Open Reading Frames，ORFs），ORF1 编码 非结构蛋白，ORF2 和 ORF3 分别编码主要衣壳蛋 白 VP1 和次要结构蛋白 VP2。根据 VP1 蛋白编码 的序列不同可分为 7 个基因群（GI~GVI），其中 GI、 GII和 GIV 可感染人类。 NoV 是引起人类急性胃肠炎的主要原因之一， 可导致散发或暴发。在全球范围内，约五分之一的 腹泻病例由 NoV 引起［2］ 。NoV 所致胃肠炎虽然属 于自限性疾病，但可导致婴儿和老年人产生严重的 症状甚至死亡。国家突发公共卫生事件信息管理 系统报告，在 2012~2016 年间我国 24 个省 96 个城 市共发生 313 次由 NoV 引起的暴发事件，其中 2016 年 NoV 暴发 109 次［3］ 。由于 NoV 无症状携带者和 不选择就医的轻症患者较多，所以临床病例的监测 数据不能完全反映病原真正的流行病学特征，生活 污水中检测到的 NoV 序列和人群中胃肠炎病例的 NoV 序列密切相关［4］ 。鉴于此，本研究在 2016 年对 山东省济南和临沂两地城市污水中的 NoV 进行了 监测分析，获取监测地区 NoV 分子流行病学及其系 统进化特征，以探索胃肠炎病毒环境监测的重要 性，并为当地 NoV 胃肠炎的防控提供科学依据。 材料与方法 1 污水的采集与浓缩 本研究以山东省济南和临沂两地为监测点，于 2016 年 1~12 月每月中旬分别采集两地污水处理厂 进水口处的污水标本 1 L，所采水样低温运输至实 验室 4℃保存，于 24 小时内采用阴离子膜吸附洗脱 法对采集的污水进行 100 倍的浓缩［5］ ，最终浓缩液 体积为 10 ml，置于-80℃冻存。 2 病毒 RNA 的提取 使 用 美 国 QIAGEN 公 司 的 QIAamp Viral RNA Mini Kit 试剂盒，根据使用说明操作，从 140 μl 污水浓缩液中提取总 RNA，加入 1 μ（l 40 U）RNa⁃ sin，置于-80℃冻存。 收稿日期：2018⁃01⁃16；修回日期：2018⁃02⁃25 基金项目：泰山学者工程专项经费资助（ts.201511105）；国家自 然科学基金项目（81573209），题目：环境污水中人类胃肠炎病毒的 型别多样性、遗传进化规律及其与人群疾病发生的关系；山东省自 然科学基金项目（ZR2014HM076），题目：基于环境污水监测的诺如 病毒基因型分布和分子流行病学研究。 作者简介：刘姗姗（1993-），女，湖北省襄阳市人，硕士研究生， 主要从事诺如病毒方面的研究，E-mail：shanshanyou@foxmail.com ∗ 通讯作者：宋艳艳（1963-），副教授，Tel：0531-88382625， E - mail：yysong@sdu. edu. cn；徐 爱 强（1963 -），主 任 医 师 ，Tel： 0531-82679606，E-mail：aqxuepi@163.com DOI：10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003356 网络首发时间：2018-04-08 13:23:00 网络首发地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1865.R.20180406.1825.008.html

病毒学报 3逆转录-聚合酶链反应 的诺如病毒序列为412条。包括234个G序列和 使用 SuperScript Ill One- step RT- PCR Sys-178个Gl序列,分别属于6个GI基因型 tem with Platinum Tag一步法试剂盒对 NoV GI和(G1.1~G1.6)和8个GI基因型(GI1、GI.2、GI3 GI的ORF1和ORF2部分片段进行基因扩增。扩GI14、GI.5、GI.9、GI.13和GI.17)(表1)。GI主 增 NoV GI基因组所用引物为G1-SKF(CTG要基因型为GL.6(56.8%,133/234),其次为GI.2 CCC GAA TTY GTA AAT GA)F G1-SKR((9.4%, 22/234) GI. 3(10.7%, 25/234)FLl GI.5 CCA ACC CAR CCA TTR TAC A);扩增NoV(15.8%,37/234)。GⅡ主要基因型为GI.17 GII基因组所用引物为COG2F( CAR GAR BCN(59.6%,106/178),其次为GI.3(32.6%,58/178)。 TG TTY AGR TGG ATG AG)和G2-SKR两地检出较多的基因型依次为GI.6、GI.17和 ( CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT)。GI3。 RT—PCR反应体系体积为50μL,程序设置为 NoV基因型分布存在一定程度的地区差异,在 50℃30min,94℃2min;94℃15s,50℃30s,68℃1济南检出5个GI基因型和8个GIl基因型,在临沂 min,共40个循环;68℃5min后转4℃保存。 检出6个GI基因型和4个G∏基因型。G1.1仅见于 4PCR产物的回收、克隆和测序 临沂,GII.1、GI9、GI.13和GIL.15仅见于济南。其 NoV GI和GIl的引物扩增的目的片段大小分他基因型虽在两地均有分布,但检出频率存在一定 别为330bp和387bp,RT一PCR反应产物用1.5%差异,除GI.2济南较多见外,其他各型均临沂多见 的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定,符合上述片段大小的且GI.17和GI3更为突出。 扩增产物判断为阳性。使用 QIAquick Gel Extrac 总体来看NoV无明显季节分布差异,主要流行 tion Kit试剂盒对阳性产物进行切胶回收,通过TA型GL.6和GI.17全年均有检出,GI3多数月份可 克隆连接到pGEM@- T Easy载体中,连接产物通检出。GL.1和GI4主要见于寒冷季节,但检出频 过热休克法转入至感受态大肠杆菌JM109细胞中。率较低 再经过蓝白斑筛选,每份标本挑取GⅠ和GⅡ的阳性2同源性比较和序列分析 克隆各10个,共挑取480个阳性克隆,送至上海生 同源性比较显示,本次研究所获取的各型别 物工程股份有限公司测序。 oV序列氨基酸同源性均较高,大多数同一型别有 5基因分型和系统进化分析 较高的核苷酸同源性,少数型别GL.3、GL.5、GI.6和 使用 Bioedit5.0.6软件进行序列剪切、比对和GIL3的型内核苷酸同源性略低,且该型别在济南和 同源性分析,使用NoⅤ在线分型工具(htp://www.临沂两地内均显示同源性略低。(表2)。 rivm. nl/mpf/ norovirus/ typingtool)对获得的NoV 本研究选取山东两监测地区NoV主要流行型 GI和GⅡ序列进行分型。使用Mage5.0软件基于别(Gl6、GI.3和GI17)序列与国内外其他参考序 Neighbor- Joining法构建系统发生树,通过1000次列比较、构建基于VP1编码区部分序列的系统进化 重复 bootstrap检验评估建树可靠性。 树,分离地点为同一城市且核苷酸同源性大于98% 的序列仅选取1条为代表(图1)。 结果 系统发生学分析显示GL.6序列可分为两个基 因簇(基因簇A和基因簇B),大部分GI.6序列都属 NoV检出情况与型别分布 于基因簇A,提示该分支是山东GI6的主要传播 本研究在济南、临沂两地采集污水处理厂处理链。除序列(JN596)和(LY1620)外,GI.6的型内核 前污水,每月每地采集1份标本,从2016年1月采集苷酸同源性为971%~100.0%。序列(JN596)和 至12月,共计24份污水标本。经RT一PCR检测分(LY1620)与GI.6其他序列的同源性较低,均为 析,24份标本中有23份标本均检出GI和GⅡ基因872%~88.8%,与南宁参考序列(KM246916)亲缘 型,济南9月标本仅检出GI未检出GIl送去测序关系较近,处于同一个进化簇内,且与其有较高的 的480个克隆中,由于测序不成功损失部分序列,且核苷酸同源性,分别为984%和96.8% 获得的序列中有部分为非特异性序列,包括短片段 GII3序列和广东参考序列(KY407194)核苷酸 插入、人类基因组序列、植物病毒序列等,最终获得同源性为97.7%~100.0%,与其有较近的亲缘关

病 毒 学 报 3 逆转录-聚合酶链反应 使用 SuperScript III One-step RT-PCR Sys⁃ tem with Platinum Taq 一步法试剂盒对 NoV GI 和 GII 的 ORF1 和 ORF2 部分片段进行基因扩增。扩 增 NoV GI 基 因 组 所 用 引 物 为 G1-SKF（CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA）和 G1-SKR（ CCA ACC CAR CCA TTR TAC A）；扩 增 NoV GII 基 因 组 所 用 引 物 为 COG2F（CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG）和 G2-SKR （CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT）［6］。 RT-PCR 反 应 体 系 体 积 为 50 μL，程 序 设 置 为 ： 50℃ 30 min，94℃ 2 min；94℃ 15 s，50℃ 30 s，68℃ 1 min，共 40 个循环；68℃ 5 min 后转 4℃保存。 4 PCR 产物的回收、克隆和测序 NoV GI 和 GII 的引物扩增的目的片段大小分 别为 330 bp 和 387 bp，RT-PCR 反应产物用 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，符合上述片段大小的 扩增产物判断为阳性。使用 QIAquick Gel Extrac⁃ tion Kit 试剂盒对阳性产物进行切胶回收，通过 TA 克隆连接到 pGEM®-T Easy 载体中，连接产物通 过热休克法转入至感受态大肠杆菌 JM109 细胞中。 再经过蓝白斑筛选，每份标本挑取 GI 和 GII 的阳性 克隆各 10 个，共挑取 480 个阳性克隆，送至上海生 物工程股份有限公司测序。 5 基因分型和系统进化分析 使用 BioEdit 5.0.6 软件进行序列剪切、比对和 同源性分析，使用 NoV 在线分型工具（http：//www. rivm. nl / mpf / norovirus / typingtool）对 获 得 的 NoV GI 和 GII 序列进行分型。使用 Mage 5.0 软件基于 Neighbor-joining 法构建系统发生树，通过 1000 次 重复 bootstrap 检验评估建树可靠性。 结 果 1 NoV 检出情况与型别分布 本研究在济南、临沂两地采集污水处理厂处理 前污水，每月每地采集 1 份标本，从 2016 年 1 月采集 至 12 月，共计 24 份污水标本。经 RT-PCR 检测分 析，24 份标本中有 23 份标本均检出 GI 和 GII 基因 型，济南 9 月标本仅检出 GI 未检出 GII。送去测序 的 480 个克隆中，由于测序不成功损失部分序列，且 获得的序列中有部分为非特异性序列，包括短片段 插入、人类基因组序列、植物病毒序列等，最终获得 的诺如病毒序列为 412 条。包括 234 个 GI 序列和 178 个 GII 序 列 ，分 别 属 于 6 个 GI 基 因 型 （GI.1~GI.6）和 8 个 GII 基因型（GII.1、GII.2、GII.3、 GII.4、GII.5、GII.9、GII.13 和 GII.17）（表 1）。GI 主 要 基 因 型 为 GI. 6（56.8%，133 / 234），其 次 为 GI. 2 （9.4%，22 / 234）、GI. 3（10.7%，25 / 234）和 GI. 5 （15.8%，37 / 234）。 GII 主 要 基 因 型 为 GII. 17 （59.6%，106/178），其次为 GII.3（32.6%，58/178）。 两 地 检 出 较 多 的 基 因 型 依 次 为 GI. 6、GII. 17 和 GII.3。 NoV 基因型分布存在一定程度的地区差异，在 济南检出 5 个 GI 基因型和 8 个 GII 基因型，在临沂 检出 6 个 GI 基因型和 4 个 GII 基因型。G1.1 仅见于 临沂，GII.1、GII.9、GII.13 和 GII.15 仅见于济南。其 他基因型虽在两地均有分布，但检出频率存在一定 差异，除 GI.2 济南较多见外，其他各型均临沂多见， 且 GII.17 和 GII.3 更为突出。 总体来看 NoV 无明显季节分布差异，主要流行 型 GI.6 和 GII.17 全年均有检出，GII.3 多数月份可 检出。GI.1 和 GII.4 主要见于寒冷季节，但检出频 率较低。 2 同源性比较和序列分析 同 源 性 比 较 显 示 ，本 次 研 究 所 获 取 的 各 型 别 NoV 序列氨基酸同源性均较高，大多数同一型别有 较高的核苷酸同源性，少数型别 GI.3、GI.5、GI.6 和 GII.3 的型内核苷酸同源性略低，且该型别在济南和 临沂两地内均显示同源性略低。（表 2）。 本研究选取山东两监测地区 NoV 主要流行型 别（GI.6、GII.3 和 GII.17）序列与国内外其他参考序 列比较、构建基于 VP1 编码区部分序列的系统进化 树，分离地点为同一城市且核苷酸同源性大于 98% 的序列仅选取 1 条为代表（图 1）。 系统发生学分析显示 GI.6 序列可分为两个基 因簇（基因簇 A 和基因簇 B），大部分 GI.6 序列都属 于基因簇 A，提示该分支是山东 GI.6 的主要传播 链。除序列（JN596）和（LY1620）外，GI.6 的型内核 苷 酸 同 源 性 为 97.1%~100.0%。 序 列（JN596）和 （LY1620）与 GI. 6 其 他 序 列 的 同 源 性 较 低 ，均 为 87.2%~88.8%，与南宁参考序列（KM246916）亲缘 关系较近，处于同一个进化簇内，且与其有较高的 核苷酸同源性，分别为 98.4% 和 96.8%。 GII.3 序列和广东参考序列（KY407194）核苷酸 同 源 性 为 97.7%~100.0%，与 其 有 较 近 的 亲 缘 关 · 2 ·

刘姗姗,等.基于生活污水监测的诺如病毒分子流行病学研究 系。多数GI1.3序列属于同一个分支,仅序列海参考序列(KU953397、KU953394)亲缘关系较 (LY540-2)属于另一个分支,该分支序列与广东参近,核苷酸同源性为989%~100.0%,数条序列与 考序列(KY407194)核苷酸同源性为100%。 珠海变异株(KT253245)、江苏变异株 本研究共获得4条GI4序列,均属于 Sydney(KR270448)和意大利参考序列(KT346356)处于 2012变异株,与原型株(JX459908)的核苷酸同源性同一个进化簇内,核苷酸同源性均为99.6% 为977%~980%。 100%。3条序列(LY542-2、LY542-3和 GII.17的型内核苷酸同源性为97.5%~LY818-9)与 Kawasaki308变异株核苷酸同源性为 100.0%,GI.17各序列聚集在同一个分支,均属于100%,分离地点皆为临沂市。 Kawasaki308(LC037415)变异株。大部分序列与 表1山东监测地区城市污水中NoV的数量 Table 1 Number of NoV sequences detected in sewage in Shandong Province, China Linyi Feb Mar Apr May Jun Jul Aug Sep Oet Jan Feb Mar Apr May Jun Jal Aug Sep Oet Now Dee (175)0003333310001614.0)37(15 272(60)66 661053.5) (333)

刘姗姗，等 . 基于生活污水监测的诺如病毒分子流行病学研究 系 。 多 数 GII. 3 序 列 属 于 同 一 个 分 支 ，仅 序 列 （LY540-2）属于另一个分支，该分支序列与广东参 考序列（KY407194）核苷酸同源性为 100%。 本研究共获得 4 条 GII.4 序列，均属于 Sydney 2012 变异株，与原型株（JX459908）的核苷酸同源性 为 97.7%~98.0%。 GII. 17 的 型 内 核 苷 酸 同 源 性 为 97.5%~ 100.0%，GII.17 各序列聚集在同一个分支，均属于 Kawasaki 308（LC037415）变异株。大部分序列与 上海参考序列（KU953397、KU953394）亲缘关系较 近，核苷酸同源性为 98.9%~100.0%，数条序列与 珠 海 变 异 株 （KT253245）［7］ 、江 苏 变 异 株 （KR270448）［8］ 和意大利参考序列（KT346356）处于 同 一 个 进 化 簇 内 ，核 苷 酸 同 源 性 均 为 99.6%~ 100%。 3 条 序 列 （LY542 -2、LY542-3 和 LY818-9）与 Kawasaki 308 变异株核苷酸同源性为 100%，分离地点皆为临沂市。 表 1 山东监测地区城市污水中 NoV 的数量 Table 1 Number of NoV sequences detected in sewage in Shandong Province，China GI.1 GI.2 GI.3 GI.4 GI.5 GI.6 GII.1 GII.2 GII.3 GII.4 0 1 1 0 0 8 0 0 0 0 0 3 0 0 0 8 1 0 1 0 0 3 0 0 1 8 0 0 1 0 0 2 0 0 2 8 0 0 0 0 0 2 0 0 1 7 0 0 2 0 0 2 0 1 1 6 0 0 1 0 0 1 1 0 1 6 0 0 3 0 0 0 3 0 0 6 0 0 4 0 0 0 3 0 0 4 0 0 0 0 0 0 2 2 5 1 0 0 1 0 0 0 0 0 2 8 0 1 3 2 0 0 0 0 8 2 0 0 8 0 0（0） 14 （11.7） 10 （8.3） 3（2.5） 21 （17.5） 72（60） 1（1.4） 1（1.4） 24 （33.3） 2（2.8） 0 0 2 2 0 6 0 0 9 1 0 1 1 1 0 6 0 1 8 1 0 1 2 0 0 6 0 0 3 0 0 0 0 0 3 7 0 0 0 0 0 1 2 0 3 4 0 0 3 0 0 0 1 0 3 4 0 0 2 0 0 0 1 1 3 4 0 0 1 0 0 0 0 0 3 7 0 0 1 0 0 5 0 1 1 3 0 0 1 0 3 0 2 1 0 4 0 0 2 0 5 0 1 0 0 4 0 0 4 0 0 0 3 0 0 6 0 0 0 0 8（7.0） 8（7.0） 15（13.2） 6（5.3） 16（14.0） 61（53.5） 0（0） 1（0.9） 34（3.1） 2（1.9） 8（3.4） 22（9.4） 25（10.7） 9（3.8） 37（15.8） 133 （56.8） 1（0.6） 2（1.1） 58（32.6） 4（2.2） Geno⁃ type Jinan Jan Feb Mar Apr May Jun Jul Aug Sep Oct Nov Dec Sum （%） Linyi Jan Feb Mar Apr May Jun Jul Aug Sep Oct Nov Dec Sum （%） Sum （%1 ） · 3 ·

续表 an Feb Mar Apr May Jun Jul Aug Sep Det Now Dee (s) Jan Feh Mar Apr May Jun Jul Aug Sep C90000 0001(14)0000000 1(06 4(22) 86969(6s)10 121414141819 187191820 101918171916151820202018220 Note: 'constituent ratio within a genogroup. 本次共检出14种NoV基因型在山东监测地区的城 市污水管网中循环,其中检出数量最多的两个基因 讨论 型为G1.6和GI.17,且全年各月份都有检出,表明 G1.6和GI.17在2016年山东监测地区有较高的流 本研究监测地区生活污水中 NoV GI和No GI的检出率为100%,显示NoV在当地的高流行 行强度。济南检出8个GⅡ基因型临沂仅检出4个 态势,与邓丽丽等人对南宁市的监测结果一致。GⅡ基因型,说明NoV在监测地区间型别分布存在 一定的差异。 表2山东环境监测地区NoⅤ各基因型P1核苷酸和氨基酸同源性 Table 2 Nucleotide identities among Shandong sequen Nucleotide identities( % Amino acids( %) G GLI 993-100.0 993~100.0 990~100.0 90~100.0 984~1 98.7~100 98.4~100.0 990~100.0 97.1~100.0 84.3~100.0 95.2~100.0 GL4 98.0~99.0 99.0~99.6 980-99.6 97.1-99.0 990~100.0 971-100.0 Ls 84.7~100 97.1~100.0 97.1~100.0 96.1-100.0 GL6 87.2~100.0 87.2~100.0 96.l~100.0 94.2~100.0 94.2~100.0 GIL2 GI3 96.7~100.0 0~100.0 940~100.0 96.0~100.0 89.2~100.0 97.7~993 97.0~100.0 GI.13 970~990 97.0-990 98.0~1000 980~100.0 GILIS GILI 975~100.0 97.8~100.0 96.8~100.0

病 毒 学 报 GII.9 GII.13 GII.15 GII.17 Total 0 0 0 2 12 0 0 0 1 14 0 0 0 1 14 0 0 0 2 14 1 2 0 3 18 0 1 0 7 19 0 0 0 7 19 0 0 1 4 18 0 0 0 0 7 0 0 0 8 19 0 0 1 1 18 0 1 0 1 20 1（1.4） 4（5.6） 2（2.8） 37 （51.4） 192 0 0 0 0 20 0 0 0 0 19 0 0 0 6 18 0 0 0 7 17 0 0 0 6 19 0 0 0 6 16 0 0 0 5 15 0 0 0 7 18 0 0 0 9 20 0 0 0 8 20 0 0 0 6 20 0 0 0 9 18 0（0） 0（0） 0（0） 69（65.1） 220 1（0.6） 4（2.2） 2（1.1） 106 （59.6） 412 续表 Geno⁃ type Jinan Jan Feb Mar Apr May Jun Jul Aug Sep Oct Nov Dec Sum （%） Linyi Jan Feb Mar Apr May Jun Jul Aug Sep Oct Nov Dec Sum （%） Sum （%1 ） Note：1 constituent ratio within a genogroup. 讨 论 本研究监测地区生活污水中 NoV GI 和 NoV GII 的检出率为 100%，显示 NoV 在当地的高流行 态势，与邓丽丽［9］ 等人对南宁市的监测结果一致。 本次共检出 14 种 NoV 基因型在山东监测地区的城 市污水管网中循环，其中检出数量最多的两个基因 型为 GI.6 和 GII.17，且全年各月份都有检出，表明 GI.6 和 GII.17 在 2016 年山东监测地区有较高的流 行强度。济南检出 8 个 GII 基因型临沂仅检出 4 个 GII 基因型，说明 NoV 在监测地区间型别分布存在 一定的差异。 表 2 山东环境监测地区 NoV 各基因型 VP1 核苷酸和氨基酸同源性 Table 2 Nucleotide identities among Shandong sequence Genotypes GI.1 GI.2 GI.3 GI.4 GI.5 GI.6 GII.1 GII.2 GII.3 GII.4 GII.9 GII.13 GII.15 GII.17 Nucleotide identities（%） Jinan / 98.4~100 84.7~100 98.0~99.0 84.7~100 88.2~100.0 / / 96.7~100.0 98.3 / 97.0~99.0 97.0 98.9~100.0 Linyi 99.3~100.0 98.7~100 84.7~100 99.0~99.6 84.7~100 87.2~100.0 / / 97.0~100.0 99.3 / / / 98.2~100.0 Jinan and Linyi 99.3~100.0 98.4~100.0 84.3~100.0 98.0~99.6 84.3~100.0 87.2~100.0 / 95.7 94.0~100.0 97.7~99.3 / 97.0~99.0 97.0 97.5~100.0 Amino acids（%） Jinan / 97.1~100 98.0~100 97.1~99.0 97.1~100.0 96.1~100.0 / / 95.0~100.0 98.0 / 98.0~100.0 93.7 97.8~100.0 Linyi 99.0~100.0 99.0~100.0 95.2~100.0 99.0~100.0 97.1~100.0 94.2~100.0 / / 96.0~100.0 100.0 / / / 96.8~100.0 Jinan and Linyi 99.0~100.0 97.1~100.0 95.2~100.0 97.1~100.0 96.1~100.0 94.2~100.0 / 98 89.2~100.0 97.0~100.0 / 98.0~100.0 93.7 96.8~100.0 Note：“/”means“cannot be calculated”. · 4 ·