实验十九病毒学实验技术 目的要求 通过实验掌握常用的病毒学实验技术和诊断方法 操作步骤 一、病毒诊断用病料的采集 病毒分离用生物学材料的最理想的采集时期，是在机体尚未产生抗体之前的疾病急性 期。 各种病料，例如血液、鼻咽拭子、粪、尿、脓汁、水泡液、皮肤病变、脊髓液和活体穿 刺材料以及剖检时采取的组织，均可用于病毒分离。每个具体疾病需要采取什么样的生物标 本，可参考有关疾病的叙述，特别是其诊断部分。 规则适用于病毒分离用的组织的正确选择。呼吸道疾病在急性期，通常在扇 在痘病的水 泡液中或皮内也可发现病毒。许多全身性卡他性疾病具 有病毒血症期，易于由血液中分离到病毒。实际上急性发病期间，机体的所有分泌物中都含 有病毒。与中枢神经系统有关的疾病较特殊，但也可由血液或病死动物的脑内分离病毒。采 取组织标本时一个最为重要的注意事项，就是必须在动物死亡后立即进行 一必要时可扑杀 频死动物，就更有利干病毒分离。同时应采取该动物血液作血清学试哈在冰冻前必须生从 全血中分离血清， 因为溶血标本经常不再能做某些血清学试验 各种病毒的生物物理学和生物化学特性明显不同。许多病毒对热及酸敏感，故在采集材 料时必须特别注意。尤其是必须采取新鲜材料，并立即置-60℃至-70℃下冰冻。此外，在用 这些病料接种组织培养物或试验动物分高病毒时，时间尽量要短。如无其他方法，可将组织 标本低温冰冻后置.20℃保存，等待取来干冰后再贮藏和送往实验室。将标木放入宽口保温 瓶或以泡沫苯乙烯隔热的纸板盒内，再用冰充填，也可达到这一目的。如果没有干冰，则可 应用50%甘油：某些病毒在此种溶液中能比其他 一些病毒存活更久。将小块组织、粪或料 液装入小瓶内，再向瓶内注满50%甘油，并贮存于6℃ 组织标本应以无菌器械在无南条件下采取。如果想要了解组织中的病毒分布，则必须应 用分开的器械采取每个组织。经常应用紧盖的灭菌旋帽瓶子贮存可疑的组织和液体。如将液 体标本瓶放入干冰内，则应紧盖瓶塞，因干冰的气相就是CO2,CO2可因改变液体的pH值 使不耐酸的病毒灭活 如果瓶盖漏气，则将其放入密封的塑料袋内也可达到目的 二、包涵体的检 用狂犬病脑切片的内基氏(Neg)小体或其他包涵体标本片示教。若有狂犬病的病料 组织，可用清洁的玻片作触片，干燥后置甲醇中固定，以姬姆萨氏染液染1小时，水洗，干 燥，镜检。 通常可用塞勒(Seller)氏染色法检查狂犬病的包涵体 (一)塞勒氏染液配 1.先配好1%美兰（即亚甲蓝）的纯甲醇溶液和1%碱性复红（即碱性一品红）的纯用 醇溶液。两液分别置瓶中加塞塞紧后，于冷处可长期保存。 2.用前将两份美兰液与一份复红液混合，即为塞勒氏染液。用前试验，以神经组织间 质染成淡红色为妥，若红色过浅前加复红液，红色过深酌加美兰液。 (二)塞勒氏染色法 将新鲜脑组织触 触片 不干也可以)浸于塞勒氏染液3秒钟，取出，用普通 水冲洗，自然干燥后镜检。 (三)结果狂犬病包涵体在神经组织的胞质中
实验十九 病毒学实验技术 目的要求 通过实验掌握常用的病毒学实验技术和诊断方法。 操作步骤 一、病毒诊断用病料的采集 病毒分离用生物学材料的最理想的采集时期，是在机体尚未产生抗体之前的疾病急性 期。 各种病料，例如血液、鼻咽拭子、粪、尿、脓汁、水泡液、皮肤病变、脊髓液和活体穿 刺材料以及剖检时采取的组织，均可用于病毒分离。每个具体疾病需要采取什么样的生物标 本，可参考有关疾病的叙述，特别是其诊断部分。 有一些总的规则适用于病毒分离用的组织的正确选择。呼吸道疾病在急性期，通常在鼻 或咽分泌物排出病毒。在痘病的水泡液中或痂皮内也可发现病毒。许多全身性卡他性疾病具 有病毒血症期，易于由血液中分离到病毒。实际上急性发病期间，机体的所有分泌物中都含 有病毒。与中枢神经系统有关的疾病较特殊，但也可由血液或病死动物的脑内分离病毒。采 取组织标本时一个最为重要的注意事项，就是必须在动物死亡后立即进行——必要时可扑杀 濒死动物，就更有利于病毒分离。同时应采取该动物血液作血清学试验,在冰冻前必须先从 全血中分离血清，因为溶血标本经常不再能做某些血清学试验。 各种病毒的生物物理学和生物化学特性明显不同。许多病毒对热及酸敏感，故在采集材 料时必须特别注意。尤其是必须采取新鲜材料，并立即置-60℃至-70℃下冰冻。此外，在用 这些病料接种组织培养物或试验动物分离病毒时，时间尽量要短。如无其他方法，可将组织 标本低温冰冻后置-20℃保存，等待取来干冰后再贮藏和送往实验室。将标本放入宽口保温 瓶或以泡沫苯乙烯隔热的纸板盒内，再用冰充填，也可达到这一目的。如果没有干冰，则可 应用 50％甘油；某些病毒在此种溶液中能比其他一些病毒存活更久。将小块组织、粪或粘 液装入小瓶内，再向瓶内注满 50％甘油，并贮存于 6℃。 组织标本应以无菌器械在无菌条件下采取。如果想要了解组织中的病毒分布，则必须应 用分开的器械采取每个组织。经常应用紧盖的灭菌旋帽瓶子贮存可疑的组织和液体。如将液 体标本瓶放入干冰内，则应紧盖瓶塞，因干冰的气相就是 CO2，CO2 可因改变液体的 pH 值 使不耐酸的病毒灭活。如果瓶盖漏气，则将其放入密封的塑料袋内也可达到目的。 二、包涵体的检查 用狂犬病脑切片的内基氏（Negri）小体或其他包涵体标本片示教。若有狂犬病的病料 组织，可用清洁的玻片作触片，干燥后置甲醇中固定，以姬姆萨氏染液染 1 小时，水洗，干 燥，镜检。 通常可用塞勒（Seller）氏染色法检查狂犬病的包涵体。 （一）塞勒氏染液配制 1．先配好 1％美兰（即亚甲蓝）的纯甲醇溶液和 1％碱性复红（即碱性一品红）的纯甲 醇溶液。两液分别置瓶中加塞塞紧后，于冷处可长期保存。 2．用前将两份美兰液与一份复红液混合，即为塞勒氏染液。用前试验，以神经组织间 质染成淡红色为妥，若红色过浅酌加复红液，红色过深酌加美兰液。 （二）塞勒氏染色法 将新鲜脑组织触片（触片 不干也可以）浸于塞勒氏染液 3 秒钟，取出，用普通 水冲洗，自然干燥后镜检。 （三）结果 狂犬病包涵体在神经组织的胞质中
嗜酸性，呈樱桃红色。嗜碱性组织与细胞核呈深蓝色，神经细胞质呈蓝紫色，间质呈粉红色， 神经纤维呈桃红色，神经鞘不色（见图实20-1）。 三、鸡胚接种 (一)鸡蛋选择和孵化选健康无病鸡群的新鲜受精蛋。鸡胚对所要接种的病毒应无免 疫力，因为其抗体可由母鸡经卵黄而传给胚胎。以来航鸡蛋或其它白壳蛋为好，因为白壳蛋 照蛋时较易于观察。孵化时以孵卵箱较好，培养细菌的温箱也可以用，但和解小鸡一样，特 别要求温度、翻蛋和湿度适当相对湿度为60%左右，所用温度和解小鸡相似，但最低可用 36C, 般37.5℃，高可到385℃，每日翻蛋最少 图20-1狂犬病的包涵体 次，开始可以将鸡蛋横放，要接种的前两天立放 气室向上，接种前两天特别注意鸡胚位置，希望近 中央，不要过分偏在一边，胚胎偏在一边易死亡。接种前两天若发现过分偏在一边，照蛋后 将偏在一边的胚胎朝下放，可以桥正到鸡胚趋向中央 解化三、 四天 ,可用照蛋灯在暗室观察，鸡胚发有处的血管即明显可见。没有鸡胚发有 也无血管的是未受精蛋。有鸡胚但鸡胚固定一处不动且血管消散呈暗红色者是死胚。活的鸡 胚，血管及其主要分枝均明显，呈鲜红色，鸡胚可以活动。实验室接种用的鸡胚最小是6 日龄，最大是12、13日龄。出时鸡胚构造如图202所示。 (二)接种前准各 1.病毒的接种材料事先应经无茵检验 即接种到一管硫羟代。 酸肉汤（或肉汤、熟 肉培养基各一管)不生长要达到材料无菌， 可采取以下措施： (1)所取材料应无菌，处理（如研磨、 6 图20- 9 10日鸡龄胚构造示意 离心取上液等)过程中也无细黄污染： 1L胚外整：2卵黄：气室：4羊膜：点.羊膜整。 (2)如所取材料已污染，可在每m】 6.线毛尿囊膜：7.蛋白：8.绒毛尿囊腔 材料中加青霉素和链霉素各达1000 5000单位（常用1000一2000单位， 置室 温中1小时或冰箱中12一24小时处理。或经滤器除菌。 2.照蛋，以铅笔划出气室、胚胎的位置，若要做卵黄囊接种或血管注射，还要划出相 应的部位 3用确两在接种处的蛋声上消击，并在该处开孔 鸡胚接种方法 鸡胚接种的方法很多， 此仅列举其中较常用 一些方法。同时 当列举的接种途径有几种技术时，也仅选择其中最广泛应用的一种。图20-3 1.卵黄囊(Yok心)接种：大型的原生小体性病毒和立克次氏体易在卵黄囊膜内生长。 虽然许多较小的病毒也可用卵黄囊途径接种，但这些病毒主要侵害胚胎本身并在胚胎组织内 增殖，而不是侵害卵黄囊组织和在其中增殖。 (1)日龄和准备孵化5一7天的鸡胚较为适用，因为此时的卵黄囊较大。在检蛋灯】 检蛋 并用铅笔画出气室的边缘。气室部分的蛋壳称为壳帽，待碘矿干后，在天然气室的正 中处用钻钻一个孔。 (2)接种和孵育应用装有2.54cm长的8号针头的注射器，将针头全长穿过壳帽上的 孔直向下插（与鸡蛋的长轴平行），并把接种物注入卵黄囊内。通常接种0.2~0.5ml。随后 用石蜡一 一凡土林混合物封闭蛋壳升，并将鸡蛋置37℃辉有」 (3)收获程序 收获时将蛋直立于蛋盘内。用无菌镊子打碎蛋壳，并将壳帽除去。将 暴露的膜撕去，并用去掉了嘴的灭菌10ml吸管吸取卵黄。如需收获卵黄囊膜，可将蛋内容 物迅速倾于一个灭菌平皿内。卵黄囊常在操作时破裂。卵黄囊呈深黄色，易于识别。用无菌
嗜酸性，呈樱桃红色。嗜碱性组织与细胞核呈深蓝色，神经细胞质呈蓝紫色，间质呈粉红色， 神经纤维呈桃红色，神经鞘不着色（见图实 20-1）。 三、鸡胚接种 （一）鸡蛋选择和孵化 选健康无病鸡群的新鲜受精蛋。鸡胚对所要接种的病毒应无免 疫力，因为其抗体可由母鸡经卵黄而传给胚胎。以来航鸡蛋或其它白壳蛋为好，因为白壳蛋 照蛋时较易于观察。孵化时以孵卵箱较好，培养细菌的温箱也可以用，但和孵小鸡一样，特 别要求温度、翻蛋和湿度适当相对湿度为 60％左右，所用温度和孵小鸡相似，但最低可用 36℃，一般 37.5℃，高可到 38.5℃，每日翻蛋最少 3 次，开始可以将鸡蛋横放，要接种的前两天立放， 气室向上，接种前两天特别注意鸡胚位置，希望近 中央，不要过分偏在一边，胚胎偏在一边易死亡。接种前两天若发现过分偏在一边，照蛋后 将偏在一边的胚胎朝下放，可以矫正到鸡胚趋向中央。 孵化三、四天，可用照蛋灯在暗室观察，鸡胚发育处的血管即明显可见。没有鸡胚发育 也无血管的是未受精蛋。有鸡胚但鸡胚固定一处不动且血管消散呈暗红色者是死胚。活的鸡 胚，血管及其主要分枝均明显，呈鲜红色，鸡胚可以活动。实验室接种用的鸡胚最小是 6 日龄，最大是 12、13 日龄。此时鸡胚构造如图 20-2 所示。 （二）接种前准备 1．病毒的接种材料事先应经无菌检验， 即接种到一管硫羟代乙酸肉汤（或肉汤、熟 肉培养基各一管）不生长。要达到材料无菌， 可采取以下措施： （1）所取材料应无菌，处理（如研磨、 离心取上液等）过程中也无细菌污染； （2）如所取材料已污染，可在每 ml 材料中加青霉素和链霉素各达 1000～ 5000 单位（常用 1000～2000 单位），置室 温中 1 小时或冰箱中 12～24 小时处理。或经滤器除菌。 2．照蛋，以铅笔划出气室、胚胎的位置，若要做卵黄囊接种或血管注射，还要划出相 应的部位。 3．用碘酒在接种处的蛋壳上消毒，并在该处开孔。 （三）鸡胚接种方法 鸡胚接种的方法很多，此仅列举其中较常用的一些方法。同时， 当列举的接种途径有几种技术时，也仅选择其中最广泛应用的一种。图 20-3 1．卵黄囊（Yolk sac）接种：大型的原生小体性病毒和立克次氏体易在卵黄囊膜内生长。 虽然许多较小的病毒也可用卵黄囊途径接种，但这些病毒主要侵害胚胎本身并在胚胎组织内 增殖，而不是侵害卵黄囊组织和在其中增殖。 （1）日龄和准备 孵化 5～7 天的鸡胚较为适用，因为此时的卵黄囊较大。在检蛋灯上 检蛋，并用铅笔画出气室的边缘。气室部分的蛋壳称为壳帽，待碘酊干后，在天然气室的正 中处用钻钻一个孔。 （2）接种和孵育 应用装有 2.54cm 长的 8 号针头的注射器，将针头全长穿过壳帽上的 孔直向下插（与鸡蛋的长轴平行），并把接种物注入卵黄囊内。通常接种 0.2～0.5ml。随后 用石蜡——凡士林混合物封闭蛋壳孔，并将鸡蛋置 37℃孵育。 （3）收获程序 收获时将蛋直立于蛋盘内。用无菌镊子打碎蛋壳，并将壳帽除去。将 暴露的膜撕去，并用去掉了嘴的灭菌 10ml 吸管吸取卵黄。如需收获卵黄囊膜，可将蛋内容 物迅速倾于一个灭菌平皿内。卵黄囊常在操作时破裂。卵黄囊呈深黄色，易于识别。用无菌 图20-1 狂犬病的包涵体 图 20-2 9～10 日鸡龄胚构造示意图 1.胚外腔；2.卵黄囊；3.气室；4.羊膜；5.羊膜腔； 6．绒毛尿囊膜；7．蛋白； 8．绒毛尿囊腔
镊子将卵黄囊与绒毛尿囊膜分开，并与胚胎剥离，迅速移置于一个灭菌平皿内。如欲收获鸡 胚胎，可用弯头牙科探针钩住胚胎的颈部取出之，并用无菌剪刀剪去附的膜后移置于灭菌 平皿内 2.尿囊腔(Allantoic carity)接种流感病毒和新城疫病毒以及引起呼吸道感染的其他 多数病毒都易在尿囊壁的内胚层细胞内生长，并释出于尿囊液中。脑脊髓炎病毒和流行性明 腺炎病毒在用这个途径接种时也易增殖。 (1)日龄和准名取解化8一11天的鸡胚，拾蛋，并用铅笔画出气岩边缘。将蛋直立 气室向上。在鸡蛋的侧面离气室底上方几毫米、绒毛尿囊膜发有良好处选好一点。用碘酊清 毒该点及其周围部分，在蛋壳上用钻钻 孔或用针穿刺 (2)接种和孵有取一长13cm的7号针头，接在吸有接种物的小注射器上，通过蛋 壳上的钻孔，与鸡蛋长轴平行地或者呈一定角度地将针插入尿囊腔内。每个蛋注射0.2 0.5ml的接种物。随后用热的石蜡一凡士林混合物封闭蛋壳上的钻孔。将蛋置37℃孵有。 (3)尿囊液的收获为使收获时不到 因出血而有血液流到尿囊液内 可在收 前将鸡胚置冰箱内冷藏4~6小时。将鸡肝 直立放置并用无菌镊子除去气室上的蛋 壳、暴露气室底。气室底由敷覆在绒毛尿 囊膜上的内壳膜构成。用一把弯头小前将 这些膜撕去。 为了师干采集屁液可 入一把镊子，使其尖端朝向蛋壳，将胚胎 挤向一侧。此时即可应用5或10ml灭菌 吸管吸取尿囊液。 3.绒毛尿囊膜(Chorioallantoic membrane)接种 图20-3鸡胚接种途径示意图 (1)日龄和准备 取9~11日龄的 1、2尿囊腔途径：3.卵黄囊途径：4.羊膜整途径： 胚，检蛋，并用铅笔在血管最丰富处的蛋 壳上画出一个lcm2的区域，应用5%石炭酸 5.绒毛尿囊膜的界线（在其塌洛时）：6.膜場落时的 消毒蛋壳，待其干燥。不用碘面消毒，因 气室底位置：7.内壳膜：8，塌落时的绒毛尿囊膜 为酒精溶液可经蛋壳吸收，并在绒毛尿囊 9.人工气室：10.线毛尿囊膜途径：1山.羊膜腔 膜上产生病变，可能被误认为是由病毒引 12.胚胎：13.绒毛尿囊膜：14.膜外腔：5.蛋清：16. 起的。用钻子沿蛋壳上的铅笔线钻开。必 卵黄囊膜：17.卵黄囊途径：18.绒毛尿囊腔 须十分小心，切勿弄破内壳膜。随后在天 然气室上，象上述卵黄囊接种法那样的钻 孔或刺孔。将蛋平放，使钻开一小块蛋壳的一侧向上。用尖头镊子或牙科探针轻轻地将己钻 开的蛋壳取去。此时暴露出内壳膜，它的下面就是绒毛尿囊膜。滴上 一滴茵生理盐水 ,使 内壳膜软化。取一长约0.64cm的7号针头连接于1个ml注射器上，使针头尖的斜面以45 角接触这个己软化的内壳膜部分，稍稍向下一压，即可因牵引而在内壳膜上造成一个裂缝： 必须注意不要损伤下层的绒毛尿囊膜。因为内壳膜的纤维斜向行走，所以应使注射器与鸡卵 长轴呈45角，这样向下一压，就可将纤维分离而不撕斯断。随后用橡皮球在天然气室的钻 孔上吸气。也可以在吸气前先在裂缝上滴加一滴灭南盐水。吸入的盐水可以帮助绒毛尿囊膜 与内壳膜分开 部分鸡蛋内容物向原来的天然气室都分转移时，绒毛尿囊膜即塌落。绒毛 尿囊膜与内壳膜分离和绒毛尿囊膜塌落的证据，就是内壳膜变为透明。 (2)接种和孵有用一支连接7或8号针头的1ml注射器，小心地将针头经内壳膜的 裂缝插入，滴加0.1~0.2ml接种物于绒毛尿囊膜上。严格的操作应在检蛋灯上进行，以保
镊子将卵黄囊与绒毛尿囊膜分开，并与胚胎剥离，迅速移置于一个灭菌平皿内。如欲收获鸡 胚胎，可用弯头牙科探针钩住胚胎的颈部取出之，并用无菌剪刀剪去附着的膜后移置于灭菌 平皿内。 2．尿囊腔（Allantoic carity） 接种流感病毒和新城疫病毒以及引起呼吸道感染的其他 多数病毒都易在尿囊壁的内胚层细胞内生长，并释出于尿囊液中。脑脊髓炎病毒和流行性腮 腺炎病毒在用这个途径接种时也易增殖。 （1）日龄和准备 取孵化 8～11 天的鸡胚，检蛋，并用铅笔画出气室边缘。将蛋直立， 气室向上。在鸡蛋的侧面离气室底上方几毫米、绒毛尿囊膜发育良好处选好一点。用碘酊消 毒该点及其周围部分，在蛋壳上用钻钻一个孔或用针穿刺一个孔。 （2）接种和孵育 取一长 1.3cm 的 7 号针头，接在吸有接种物的小注射器上，通过蛋 壳上的钻孔，与鸡蛋长轴平行地或者呈一定角度地将针插入尿囊腔内。每个蛋注射 0.2～ 0.5ml 的接种物。随后用热的石蜡—凡士林混合物封闭蛋壳上的钻孔。将蛋置 37℃孵育。 （3）尿囊液的收获 为使收获时不致 因出血而有血液流到尿囊液内，可在收获 前将鸡胚置冰箱内冷藏 4～6 小时。将鸡胚 直立放置并用无菌镊子除去气室上的蛋 壳、暴露气室底。气室底由敷覆在绒毛尿 囊膜上的内壳膜构成。用一把弯头小剪将 这些膜撕去。为了便于采集尿囊液，可置 入一把镊子，使其尖端朝向蛋壳，将胚胎 挤向一侧。此时即可应用 5 或 10 ml 灭菌 吸管吸取尿囊液。 3 ． 绒 毛 尿 囊 膜 （ Chorioallantoic membrane）接种 （1）日龄和准备 取 9～11 日龄的鸡 胚，检蛋，并用铅笔在血管最丰富处的蛋 壳上画出一个 lcm2 的区域,应用 5％石炭酸 消毒蛋壳，待其干燥。不用碘酊消毒，因 为酒精溶液可经蛋壳吸收，并在绒毛尿囊 膜上产生病变，可能被误认为是由病毒引 起的。用钻子沿蛋壳上的铅笔线钻开。必 须十分小心，切勿弄破内壳膜。随后在天 然气室上，象上述卵黄囊接种法那样的钻 孔或刺孔。将蛋平放，使钻开一小块蛋壳的一侧向上。用尖头镊子或牙科探针轻轻地将已钻 开的蛋壳取去。此时暴露出内壳膜，它的下面就是绒毛尿囊膜。滴上一滴无菌生理盐水，使 内壳膜软化。取一长约 0.64cm 的 7 号针头连接于 l 个 lml 注射器上，使针头尖的斜面以 45° 角接触这个已软化的内壳膜部分，稍稍向下一压，即可因牵引而在内壳膜上造成一个裂缝。 必须注意不要损伤下层的绒毛尿囊膜。因为内壳膜的纤维斜向行走，所以应使注射器与鸡卵 长轴呈 45°角，这样向下一压，就可将纤维分离而不撕断。随后用橡皮球在天然气室的钻 孔上吸气。也可以在吸气前先在裂缝上滴加一滴灭菌盐水。吸入的盐水可以帮助绒毛尿囊膜 与内壳膜分开。当部分鸡蛋内容物向原来的天然气室部分转移时，绒毛尿囊膜即塌落。绒毛 尿囊膜与内壳膜分离和绒毛尿囊膜塌落的证据，就是内壳膜变为透明。 （2）接种和孵育 用一支连接 7 或 8 号针头的 1ml 注射器，小心地将针头经内壳膜的 裂缝插入，滴加 0.1～0.2ml 接种物于绒毛尿囊膜上。严格的操作应在检蛋灯上进行，以保 图 20-3 鸡胚接种途径示意图 1、2.尿囊腔途径；3.卵黄囊途径；4.羊膜腔途径； 5.绒毛尿囊膜的界线（在其塌落时）；6.膜塌落时的 气室底位置；7.内壳膜；8.塌落时的绒毛尿囊膜； 9.人工气室；10.绒毛尿囊膜途径；11.羊膜腔； 12.胚胎；13.绒毛尿囊膜；14.膜外腔；5.蛋清；16. 卵黄囊膜；17.卵黄囊途径；18.绒毛尿囊腔
证接种物确实滴在绒毛尿囊膜上，而不是穿透了绒毛尿囊膜。接种后，将鸡蛋稍行摇动，使 接种物均匀扩散于绒毛尿囊膜表面。蛋壳的开口用一小块檬皮膏封闭。继续孵有，使蛋壳窗 另一个接种方法可以不开蛋壳窗，方法如下：在已消毒的蛋壳上选好部位钻孔，达内壳 膜。用一6号针头，使针头尖的斜面向下，在钻孔的周围小心地稍稍下压针头，将内壳膜与 蛋壳分开，随后将蛋放在检蛋灯上，并在己经钻好的气室孔上吸气。当时即可清楚地见到绒 毛尿囊膜的塌落。 3)膜组织的收获 将蛋平放，蛋壳窗向上。用碘棉球消毒蛋壳窗周围，撕去橡皮 膏。用灭菌镊子除去周围蛋壳，暴露出绒毛尿囊膜。用镊子将膜夹住，并用剪刀剪下后迅速 移置于一个灭菌平皿内。 因为9或10日龄的鸡胚的绒毛尿囊膜牢固地粘连于内壳膜上，所以一个通用的方法是 在孢胚7、8日龄时就使绒毛尿蠹膜堤落，随后珠续辉有，直至准各接种时为止。接种操作 一法所述方法 进行孵有和收获。 4.羊膜(Amniotie)接种此法主要用于由咽喉洗嗽液中分离流感病毒。由于鸡胚在 发育过程中吞咽羊水，并将其中所含的病毒携带至呼吸道和肠道组织，病毒主要在这些组织 内增殖。脑脊髓炎病毒也可通过羊水腔途径进行分离。 1)日粉 月715 检蛋，确定胚胎位置，随后根据胚胎位置有 鸡蛋的侧面、气室上方蛋壳的相应位置上选点并标记。按常法处理后，象卵黄囊接种那样钻 孔。 (2)接种和解育接种时应用m1注射器，连接一个长约1.8cm的7号针头。将蛋平 放于检蛋灯上，插入针头，并缓慢地向胚胎方向刺入。刺破羊膜囊时的一个证据，就是胚胎 发生一个突然运动。随后稍将针头回抽 并注入0.10.2ml接种物 蛋壳上的钻孔用石 一凡士林混合物封闭，将蛋直立，继续孵有。 (3)羊水的采集象尿囊腔和卵黄囊收获方法那样除去蛋壳。在气室底上滴加几滴生 理盐水，使膜透明。以胚胎的眼睛作为参考依据，用连接一个短的6号针头的注射器吸取羊 水。 5其 (1)静脉内这一鸡胚接种方法实际上不常用。操作时应用12一14日龄的鸡胚。以检 蛋法标记出一根大静脉。如前述方法除去该静脉上方的一小块四方形蛋壳。滴加1小滴灭菌 矿物油于内壳膜上，使其变为透明。将一连接在小注射器上的4号针头顺血流方向插入于静 脉内。随后注入0.10.5ml的接种物。如前述，群育并收获。 (2)脑内这是培养狂犬病毒时偶而使用的方法。 四、组织培养 培养病毒的组织培养技术，都是下列5种基本方法的改良 (一)悬浮细胞培养法(Snspended-一cell method)这是一个古老但现在仍在继续 应用的方法，常用于口蹄疫病毒的培养。 (一)血浆凝块培养法(Pa ot method)应用凝固血浆（经常是鸡血浆）使组 织块贴附在玻片或试管壁上。 先在玻璃表面涂布 一层血浆膜，加入胚胎浸出液使其凝固。将 组织块置入这一基质内，即能贴附于玻璃表面并增殖。应用这一方法可以看到细胞增殖，并 可测量组织块的生长情况。这类培养物中的病毒生长，可根据下列几种方法测知： ()取培养物的液体或细胞作为病毒样品，接种于己知能发生感染的易感动物：(b) 注意其对细胞代谢的影响（亦即对某些代谢路径的抑制）：(c)观察细胞死亡（坏死）：()
证接种物确实滴在绒毛尿囊膜上，而不是穿透了绒毛尿囊膜。接种后，将鸡蛋稍行摇动，使 接种物均匀扩散于绒毛尿囊膜表面。蛋壳的开口用一小块橡皮膏封闭。继续孵育，使蛋壳窗 向上。 另一个接种方法可以不开蛋壳窗，方法如下：在已消毒的蛋壳上选好部位钻孔，达内壳 膜。用一 6 号针头，使针头尖的斜面向下，在钻孔的周围小心地稍稍下压针头，将内壳膜与 蛋壳分开。随后将蛋放在检蛋灯上，并在已经钻好的气室孔上吸气。当时即可清楚地见到绒 毛尿囊膜的塌落。 （3）膜组织的收获 将蛋平放，蛋壳窗向上。用碘酊棉球消毒蛋壳窗周围，撕去橡皮 膏。用灭菌镊子除去周围蛋壳，暴露出绒毛尿囊膜。用镊子将膜夹住，并用剪刀剪下后迅速 移置于一个灭菌平皿内。 因为 9 或 10 日龄的鸡胚的绒毛尿囊膜牢固地粘连于内壳膜上，所以一个通用的方法是 在鸡胚 7、8 日龄时就使绒毛尿囊膜塌落，随后继续孵育，直至准备接种时为止。接种操作 需在检蛋灯上进行，以保证此时绒毛尿囊膜不上升，而且接种物确实是放在绒毛尿囊膜上而 不是在尿囊腔内。随后用石蜡—凡士林混合物或橡皮膏封闭蛋壳孔。此后按第一法所述方法 进行孵育和收获。 4．羊膜（Amniotie）接种 此法主要用于由咽喉洗嗽液中分离流感病毒。由于鸡胚在 发育过程中吞咽羊水，并将其中所含的病毒携带至呼吸道和肠道组织，病毒主要在这些组织 内增殖。脑脊髓炎病毒也可通过羊水腔途径进行分离。 （1）日龄和准备 用 7～15 日龄的鸡胚，检蛋，确定胚胎位置，随后根据胚胎位置在 鸡蛋的侧面、气室上方蛋壳的相应位置上选点并标记。按常法处理后，象卵黄囊接种那样钻 孔。 （2）接种和孵育 接种时应用 lm1 注射器，连接一个长约 1.8cm 的 7 号针头。将蛋平 放于检蛋灯上，插入针头，并缓慢地向胚胎方向刺入。刺破羊膜囊时的一个证据，就是胚胎 发生一个突然运动。随后稍将针头回抽，并注入 0.1～0.2ml 接种物。蛋壳上的钻孔用石蜡 —凡士林混合物封闭，将蛋直立，继续孵育。 （3）羊水的采集 象尿囊腔和卵黄囊收获方法那样除去蛋壳。在气室底上滴加几滴生 理盐水，使膜透明。以胚胎的眼睛作为参考依据，用连接一个短的 6 号针头的注射器吸取羊 水。 5．其他 （1）静脉内 这一鸡胚接种方法实际上不常用。操作时应用 12～14 日龄的鸡胚。以检 蛋法标记出一根大静脉。如前述方法除去该静脉上方的一小块四方形蛋壳。滴加 1 小滴灭菌 矿物油于内壳膜上，使其变为透明。将一连接在小注射器上的 4 号针头顺血流方向插入于静 脉内。随后注入 0.1～0.5ml 的接种物。如前述，孵育并收获。 （2）脑内 这是培养狂犬病毒时偶而使用的方法。 四、组织培养 培养病毒的组织培养技术，都是下列 5 种基本方法的改良： （一）悬浮细胞培养法（Snspended—cell method） 这是一个古老但现在仍在继续 应用的方法，常用于口蹄疫病毒的培养。 （二）血浆凝块培养法（Plasma—dot method） 应用凝固血浆（经常是鸡血浆）使组 织块贴附在玻片或试管壁上。先在玻璃表面涂布一层血浆膜，加入胚胎浸出液使其凝固。将 组织块置入这一基质内，即能贴附于玻璃表面并增殖。应用这一方法可以看到细胞增殖，并 可测量组织块的生长情况。这类培养物中的病毒生长，可根据下列几种方法测知： （a）取培养物的液体或细胞作为病毒样品，接种于已知能发生感染的易感动物；（b） 注意其对细胞代谢的影响（亦即对某些代谢路径的抑制）；（c）观察细胞死亡（坏死）；（d）
检测是否有血凝素存在：()对细胞或提纯的液体进行电子显微镜检查。 (三)单层细胞培养(Monolayer cell cutures) 静止的试管培养是病毒学中最常用的 方法。这些培养物是用胰酶 散的组织制各的 自适用的特殊来源如肾 皮肤 肿瘤以及其他组织)。这种培养物内含有小的细胞团块和单个细胞。将组织用剪刀剪碎， 用盐水冲洗，除去血细胞和细胞碎屑后将其置于胰酶溶液内，并用磁力搅拌装置不断搅拌。 当细胞分散时（具体时间随胰酶消化的温度和所用组织而不同），稍予离心沉淀，用营养液 冲洗23次，除去酶用几层纱布村后讲一步稀释，使每m1中含有足够量的细胞 的生长（细胞的具体 量随细胞种类而不同) 并分装培 式管】 玻璃表面（平 试管或玻璃瓶） 产生丰盛的 单层细胞。这样制备的试管培养物可用于病毒的分离、滴定、中和试验以及研究病毒在细胞 内的生长。 (四)直接培养(Direct cultures)这种培养方法与单层细胞培养相同。在尸体剖检时 以提高病毒分离的机会，特别是在 组织内的病毒 应用的胰酶 尽可能少， 因为有些病毒可被胰酶灭活。 (五)器官培养(Organ cultures)用于接种可疑病毒材料的器官培养物，也可以如前 所述那样直接用病变组织制备。 现在最常用的是单层细胞培养，培养病以同种动物细胞为住（即牛的病毒用牛的细 胞)，以肾细胞较常用，胚胎细胞较幼年动物的细胞好，幼年动物的细胞又较成年动物的细 胞好 细胞培养对玻璃器皿洗涤要求很高，彻底洗净后用蒸馏水冲洗，再用双瘤水冲洗，干保 灭菌后备用。所有溶液均用双蒸馏水配制，所用药品试剂要用高质量的分析纯试剂。操作过 程中，严格要求无南。 五、用溶液的配制 ○胰蛋白酶溶液 以汉克斯液配制，其浓度因胰蛋白酶牌号而定 一般说来，Dif 牌用0.27%，E·Mek牌用0.75%，新疆生化所产品用0.5%，其它牌号要经试验确定。按 量将胰蛋白酶加入汉克斯氏液后，置37℃20分钟使其完全溶解，滤器除南（不能加温，更 不能高压)无菌检查合格后置-20C保存，用前加适量的3.5%或1.4%NahCo:使其DH为 7.67.8。出液供消化细朐用。 汉克斯 (Hank's)氏液，亦称亨克氏液 原液甲一。 NaCl 160g MgSO4·7H0 2g KC1 MgC12·6HO 2g 按顺序加入到800m1双缩水中 物溶解后再加另一物。 原液甲二：CaC122.8g溶于100ml双馏水中。 以上两液混合，加双馏水至1000ml,加2ml氯仿防腐，保存于5℃。 原液乙： NaH2PO4·12H0 3.04g KH:PO 1.20g 葡萄糖 20g 按顺序加入到800ml双蒸馏水中。 原液乙二：0.4%酚红液100ml(0.4%酚红液是将0.4g酚红置乳钵中，边研磨边徐徐滴
检测是否有血凝素存在；（e）对细胞或提纯的液体进行电子显微镜检查。 （三）单层细胞培养（Monolayer cell cultures） 静止的试管培养是病毒学中最常用的 方法。这些培养物是用胰酶分散的组织制备的（来自适用的特殊来源,如肾、睾丸、皮肤、 肿瘤以及其他组织）。这种培养物内含有小的细胞团块和单个细胞。将组织用剪刀剪碎，并 用盐水冲洗，除去血细胞和细胞碎屑后将其置于胰酶溶液内，并用磁力搅拌装置不断搅拌。 当细胞分散时（具体时间随胰酶消化的温度和所用组织而不同），稍予离心沉淀，用营养液 冲洗 2～3 次，除去胰酶，用几层纱布过滤后进一步稀释，使每 m1 中含有足够量的细胞， 以保证良好的生长（细胞的具体数量随细胞种类而不同），并分装培养于试管内。 由肾组织制备的细胞悬液能在静置的任何玻璃表面（平皿或试管或玻璃瓶）产生丰盛的 单层细胞。这样制备的试管培养物可用于病毒的分离、滴定、中和试验以及研究病毒在细胞 内的生长。 （四）直接培养（Direct cultures） 这种培养方法与单层细胞培养相同。在尸体剖检时 采取组织或者采取活体组织，用以制备单层细胞培养物，以提高病毒分离的机会，特别是在 组织内的病毒可能很少或者因存在抗体而使病毒呈不活动状态时。应用的胰酶应尽可能少， 因为有些病毒可被胰酶灭活。 （五）器官培养（Organ cultures） 用于接种可疑病毒材料的器官培养物，也可以如前 所述那样直接用病变组织制备。 现在最常用的是单层细胞培养，培养病毒以同种动物细胞为佳（即牛的病毒用牛的细 胞），以肾细胞较常用，胚胎细胞较幼年动物的细胞好，幼年动物的细胞又较成年动物的细 胞好。 细胞培养对玻璃器皿洗涤要求很高，彻底洗净后用蒸馏水冲洗，再用双馏水冲洗，干燥 灭菌后备用。所有溶液均用双蒸馏水配制，所用药品试剂要用高质量的分析纯试剂。操作过 程中，严格要求无菌。 五、常用溶液的配制 （一）胰蛋白酶溶液 以汉克斯液配制，其浓度因胰蛋白酶牌号而定。一般说来，Difco 牌用 0.27％，E·Merk 牌用 0.75％，新疆生化所产品用 0.5％，其它牌号要经试验确定。按 量将胰蛋白酶加入汉克斯氏液后，置 37℃20 分钟使其完全溶解，滤器除菌（不能加温，更 不能高压）无菌检查合格后置-20℃保存，用前加适量的 3.5％或 1.4％ NaHCO3 使其 pH 为 7.6～7.8。此液供消化细胞用。 （二）汉克斯（Hank’s）氏液，亦称亨克氏液； 原液甲一： NaCl 160g MgSO4·7H2O 2g KC1 8g MgC12·6H2O 2g 按顺序加入到 800m1 双馏水中，一物溶解后再加另一物。 原液甲二： CaC12 2.8g 溶于 l00 ml 双馏水中。 以上两液混合，加双馏水至 1000 ml，加 2ml 氯仿防腐，保存于 5℃。 原液乙一: N aH2PO4·12H2O 3.04g KH2PO4 1.20g 葡萄糖 20g 按顺序加入到 800ml 双蒸馏水中。 原液乙二：0.4％酚红液 100 ml（0.4％酚红液是将 0.4g 酚红置乳钵中，边研磨边徐徐滴