实验六细菌的生化试验 目的要求 1.通过本试验加深对细菌生化反应原理和意义的理解： 2.掌握常规细菌生化试验操作方法。 操作步骤 一、糖类发酵（分解）试验 原理：细菌含有分解不同糖 (醇、苷)类的酶，因而分解各种糖（醇、苷）类的能力也 不一样。有些细菌分解某些糖（醇、苷）产酸（符号：+、产气（符号：O),培养基由兰 变黄（指示剂澳麝香草酚兰由兰遇酸变黄的结果），并有气泡：有些产酸，仅培养基变黄： 有些不分解糖类（符号：一），培养基仍为兰色。 (一)活用于需氧南的方法 培养基用邓亭氏(D 1)蛋白胨水溶液（蛋白胨1g,氯化销0， 100m pH7.6 按05一%的比例分别加人各种精，每00m加入2加的02溴醇香时蓝或用16肠 溴甲酚紫酒精溶液0.1ml)作指示剂。分装于试管（每一个试管事先都加有一枚倒立的小发 酵管)，10磅高压灭菌10分钟。 如在培养基中加入琼脂达0.5一0.7%，则成半固体，可省去倒立的小发酵管。 0,2%溴器香草酚蓝溶液配法： 淚麝香草酚蓝 02g 0.IN NaOH 5ml 蒸馏水 95ml 方法：从琼脂斜面的纯培养物上，用接种环取少量被检细菌接种于糖发酵管培养基中（如 为半固体，应穿刺)，在37℃培养， 一般观察2一3天，观察时用上述符号标记之。 (二)适用于厌氧菌的方法 培养基： 蛋白陈 20g 氯化钠 动形 1.6%溴甲酚紫酒精溶液1ml 10g 硫乙醇酸钠 12 蒸馏水 1000ml 将陈、盐、硫乙醇酸钠、琼脂和水放于烧瓶内，加热使融化，再加入所需的糖，调整 pH到7.0，加入指示剂， 分装试管，在10磅高压灭菌15分钟后，做成高层。 方法将厌氧菌的培养物用穿刺接种法接种于上述培养基的深部，于37℃培养。结果 观察同需氧菌。 二、V一P试验（二乙酰试验） 原理：某些细菌能从葡萄糖·丙酮酸·乙酰甲基甲醇(Acetymethyl carbinol)→2,3- 2,3-bytavlene cy小ycol),在有碱存在时氧化成二乙酰，后者和陈中的胍基 起作用，产生粉 合物。其反应式为： 2CH;COCOOH -CHCOCHOHCH十2C0: 丙酮酸 乙酰甲基甲醇 -2H CHsCHOHCHOHCH KOH CH;COCOCH
实验六 细菌的生化试验 目的要求 1．通过本试验加深对细菌生化反应原理和意义的理解； 2．掌握常规细菌生化试验操作方法。 操作步骤 一、糖类发酵（分解）试验 原理：细菌含有分解不同糖（醇、苷）类的酶，因而分解各种糖（醇、苷）类的能力也 不一样。有些细菌分解某些糖（醇、苷）产酸（符号：+）、产气（符号：○），培养基由兰 变黄（指示剂溴麝香草酚兰由兰遇酸变黄的结果），并有气泡；有些产酸，仅培养基变黄； 有些不分解糖类（符号：－），培养基仍为兰色。 （一）适用于需氧菌的方法 培养基 用邓亨氏（Dunham）蛋白胨水溶液（蛋白胨 1g，氯化钠 0.5g，水 100ml，pH7.6 按 0.5～1％的比例分别加入各种糖），每 100ml 加入 1.2ml 的 0.2％溴麝香草酚蓝（或用 1.6％ 溴甲酚紫酒精溶液 0.1ml）作指示剂。分装于试管（每一个试管事先都加有一枚倒立的小发 酵管），10 磅高压灭菌 10 分钟。 如在培养基中加入琼脂达 0.5～0.7％，则成半固体，可省去倒立的小发酵管。 0.2％溴麝香草酚蓝溶液配法： 溴麝香草酚蓝 0.2g 0.1N NaOH 5ml 蒸馏水 95ml 方法：从琼脂斜面的纯培养物上，用接种环取少量被检细菌接种于糖发酵管培养基中（如 为半固体，应穿刺），在 37℃培养，一般观察 2～3 天，观察时用上述符号标记之。 （二）适用于厌氧菌的方法 培养基： 蛋白胨 20g 氯化钠 5g 琼脂 1g 1.6％溴甲酚紫酒精溶液 1ml 糖 10g 硫乙醇酸钠 1g 蒸馏水 1000ml 将胨、盐、硫乙醇酸钠、琼脂和水放于烧瓶内，加热使融化，再加入所需的糖，调整 pH 到 7.0，加入指示剂，分装试管，在 10 磅高压灭菌 15 分钟后，做成高层。 方法 将厌氧菌的培养物用穿刺接种法接种于上述培养基的深部，于 37℃培养。结果 观察同需氧菌。 二、V－P 试验（二乙酰试验） 原理：某些细菌能从葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇（Acetymethyl carbinol）→2，3- 丁烯二醇（2，3-bytaylene cylycol），在有碱存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物 起作用，产生粉红色的化合物。其反应式为： 2CH3COCOOH——→CH3COCHOHCH3 十 2CO2 丙酮酸 乙酰甲基甲醇 CH3CHOHCHOHCH3 → − KOH 2H CH3COCOCH3
2,3丁烯二醇 丁二酮（二乙酰） 乙酰甲基甲醇 丁二酮（二乙酰） O=C-CH, HN-CNCCH. O=C-CH, +HN-CNH, N=C-CH; 丁二丽 胍基 红色化合物 培养基：含葡萄糖、KHPO4、蛋白陈各5g,完全溶解于1000ml水中后，分装试管内， 间歇灭菌或10磅10分钟灭菌。 方法： 1.O’Mea’g法 ●将被检细氯氧化钾溶于100m1蒸富水中，加入03巴型成 接种 于葡萄糖蛋白胨水培养后， 于3 一37℃培养48小时，于每毫升培养物 中加入0.1ml,猛烈摇振混合。 2.Baritt's法 试剂：6%ā-奈酚酒精溶液为甲液，40%氢氧化钾为乙液。 同上法接种培养细菌，于2ml培养液内加入甲液1ml和乙液0.4毫升，摇振混合。 试验时强阳性者约于5分钟后，可产生粉红色反应（长时间无反应，置室温过夜），次 日不变者为阴性 三、甲基红(M.R.)试验 原理：某些细菌在糖代谢过程中生成丙酮酸，有的甚至进一步被分解为甲酸、乙酸、乳 酸等，而不是生成V一P试验中的二乙酰，从而使培养基的DH下降至45或以下(V一P试 验的培养物pH常在45以上)，故加入甲基红试剂呈红色。本试验常与V一P试验一起使用， 因为前者呈阳性的细菌， 后者通常为阴性 培养基：同V一P试验培养基。 甲基红指示剂：0.1g甲基红溶于300ml95%酒精中，再加入蒸馏水200ml。 方法：接种细菌于培养液中，37℃培养2~7天后，于培养物中加入几滴试剂，变红色 者为阳性反应。 四、淀粉水解试验 原理：细菌如产生淀粉酶可将淀粉分解为糖类，在培养基上滴加碘液，可在菌落周围出 现透明区。 淀粉琼脂培养基： pH76的肉浸汤琼脂 90ml 无菌羊血清（只对不易生长的细菌才加） 5ml 无菌3%淀粉溶液 10m 将琼脂加热融化，冷却到45℃，加入淀粉溶液及羊血清，混匀后，倾注平板。 方法：将细菌划线接种于上述平板上，在37℃培养24小时。生长后取出，在菌落处滴 加革兰氏碘液少许，观察。 结果：培养基呈深蓝色，能水解淀粉的细菌及其茵落周围有透明的环 五、枸酸盐利用试验 原理：当细菌利用铵盐作为唯一氮源，并利用枸橼酸盐作为唯一碳源时，可在枸欖酸盐 培养基上生长，生成碳酸钠，并同时利用铵盐生成氢，使培养基呈碱性。 方法1：
2，3-丁烯二醇 丁二酮（二乙酰） 培养基：含葡萄糖、K2HPO4、蛋白胨各 5g，完全溶解于 1000ml 水中后，分装试管内， 间歇灭菌或 10 磅 10 分钟灭菌。 方法： 1．O’Meara’s 法 试剂：40g 氢氧化钾溶于 100ml 蒸馏水中，加入 0.3g 肌酐即成。 将被检细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养后，于 35～37℃培养 48 小时，于每毫升培养物 中加入 0.1ml，猛烈摇振混合。 2．Baritt’s 法 试剂：6％α-奈酚酒精溶液为甲液，40％氢氧化钾为乙液。 同上法接种培养细菌，于 2ml 培养液内加入甲液 1ml 和乙液 0.4 毫升，摇振混合。 试验时强阳性者约于 5 分钟后，可产生粉红色反应（长时间无反应，置室温过夜），次 日不变者为阴性。 三、甲基红（M．R．）试验 原理：某些细菌在糖代谢过程中生成丙酮酸，有的甚至进一步被分解为甲酸、乙酸、乳 酸等，而不是生成 V－P 试验中的二乙酰，从而使培养基的 pH 下降至 4.5 或以下（V－P 试 验的培养物 pH 常在 4.5 以上），故加入甲基红试剂呈红色。本试验常与 V－P 试验一起使用， 因为前者呈阳性的细菌，后者通常为阴性。 培养基：同 V－P 试验培养基。 甲基红指示剂：0.1g 甲基红溶于 300ml95％酒精中，再加入蒸馏水 200ml。 方法：接种细菌于培养液中， 37℃培养 2～7 天后，于培养物中加入几滴试剂，变红色 者为阳性反应。 四、淀粉水解试验 原理：细菌如产生淀粉酶可将淀粉分解为糖类，在培养基上滴加碘液，可在菌落周围出 现透明区。 淀粉琼脂培养基： pH7.6 的肉浸汤琼脂 90ml 无菌羊血清（只对不易生长的细菌才加） 5ml 无菌 3％淀粉溶液 10ml 将琼脂加热融化，冷却到 45℃，加入淀粉溶液及羊血清，混匀后，倾注平板。 方法：将细菌划线接种于上述平板上，在 37℃培养 24 小时。生长后取出，在菌落处滴 加革兰氏碘液少许，观察。 结果：培养基呈深蓝色，能水解淀粉的细菌及其菌落周围有透明的环。 五、枸橼酸盐利用试验 原理：当细菌利用铵盐作为唯一氮源，并利用枸橼酸盐作为唯一碳源时，可在枸橼酸盐 培养基上生长，生成碳酸钠，并同时利用铵盐生成氢，使培养基呈碱性。 方法 1：
Simmons氏培养基： 柠檬酸钠 g K2HPO 硫酸镁 0.2g 氯化钠 琼脂（洗过） NH.H2PO. g 1%溴麝香草酚蓝酒精溶液 10m 蒸馏水 加至1,000m 调整pH至6.8,15磅15分钟高压灭菌后制成斜面。 将上述培养基中的琼脂省去，制成液体培养基，同样可以应用。将被检细菌少量接种到 培养基中，37℃培养2~4日，培养基变蓝色者为阳性，不变者为阴性。 方法2： Christenten氏培养基 柠檬酸钠 5g KH2PO4 葡萄糖 0.2g 化钠 酚 胱氨酸 0.1g 琼脂 158g 酵母浸膏 0.5g 求馏水加至 1000m 有的配方尚加柠檬酸铁铵0.4 硫代硫酸钠0.08g PH不必调整。高压灭茵后做成短厚的斜面。接种时先划线后穿刺，瓣有于37℃观察七 天。阳性者培养基变红色，阴性者培养基仍为黄色。 大、明哚试验 原理：细菌分解蛋白陈中的色氨酸。生成明哚（靛基质），经与试剂中的对位一甲基氨 基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚 培养基。 邓亨氏蛋白胨溶液同（一）] 试剂：常用下述两种。 1.欧立希氏(Ebrlich's)吲引哚试剂 对位二甲基氨基苯甲醛(P-dimethyl aminobenzaldehyde) 1g 纯乙脑 95ml 浓盐酸 20m 先以乙醇溶解试剂，后加盐酸，要避光保存。 2.Kovacs试剂 对位二甲基氨基苯甲醛 戊醇（聚异戊醇） 浓盐酸 25ml
Simmons 氏培养基： 柠檬酸钠 lg K2HPO4 lg 硫酸镁 0.2g 氯化钠 5g 琼脂（洗过） 20g NH4H2PO4 1g 1％溴麝香草酚蓝酒精溶液 10ml 蒸馏水 加至 1，000ml 调整 pH 至 6.8，15 磅 15 分钟高压灭菌后制成斜面。 将上述培养基中的琼脂省去，制成液体培养基，同样可以应用。将被检细菌少量接种到 培养基中， 37℃培养 2～4 日，培养基变蓝色者为阳性，不变者为阴性。 方法 2： Christenten 氏培养基： 柠檬酸钠 5g KH2PO4 1g 葡萄糖 0.2g 氯化钠 5g 酚红 0.012g 半胱氨酸 0.1g 琼脂 15g 酵母浸膏 0.5g 蒸馏水加至 1000ml 有的配方尚加柠檬酸铁铵 0.4g，硫代硫酸钠 0.08g。 PH 不必调整。高压灭菌后做成短厚的斜面。接种时先划线后穿刺，孵育于 37℃观察七 天。阳性者培养基变红色，阴性者培养基仍为黄色。 六、吲哚试验 原理：细菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚（靛基质），经与试剂中的对位二甲基氨 基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚。 培养基：邓亨氏蛋白胨溶液[同（一）] 试剂：常用下述两种。 1．欧立希氏（Ebrlich′s）吲哚试剂 对位二甲基氨基苯甲醛（P-dimethyl aminobenzaldehyde） 1g 纯乙醇 95ml 浓盐酸 20ml 先以乙醇溶解试剂，后加盐酸，要避光保存。 2．Kovacs 试剂 对位二甲基氨基苯甲醛 5g 戊醇（聚异戊醇） 75g 浓盐酸 25ml
+NH:+CHCOCOOH N《CH.), N(CH) 对 方法：以接种环接种待试细菌的新鲜斜面培养物于邓亨氏蛋白陈溶液中，37℃培养 24~48小时后（可延长4~5天）。于培养液中加入戊醇或二甲苯2~3ml,摇匀，静置片刻 后，沿试管壁加入试剂2毫升。在戊醇或二甲苯下面的液体变红色者为阳性反应。 也可将一指头大的脱脂棉，滴上两滴欧立希氏试剂，再在同处加滴两滴高硫酸钾 (KS,0,)饱和水溶液，置于含培养液的被检试管中，离液面约半寸，置烧杯内水浴煮沸为 止，脱脂棉上出现红色为阳性。此法略繁，但省试剂且准确，因为将试剂加到液体中，吲引 和粪臭素均呈阳性，而用此法，只是吲哚（它能挥发）呈阳性反应。 亦可以滤纸片浸湿1%的二甲基苯丙烯甲醛的10%浓HC1溶液，然后以接种环刮取一环 琼脂的纯培养物涂布于该滤纸上。 细菌涂印周围呈蓝色者为阳性，细菌涂印周围无色泽变化或淡黄色者为阴性。 厌氧菌用蛋白胨水 蛋白陈 20g 葡萄糖 10g 硫乙醇酸钠 1g NazHPO:(无水) 琼脂 g 蒸馏水 1000ml 加热溶解，调整pH至7.4~7.6，过滤，分装小试管，15磅高压15分钟。 七、硫化氢试验 原理：有些细菌能分解含硫氨基酸，产生硫化氧(HS),HS会使培养基中的醋酸铅或 培养基： 肉汤琼脂 100ml 10%硫代硫酸钠溶液（新配）2.5ml 10%醋酸铅溶液 三种成份分别高压灭茵，前二者混合后待凉至60℃，加入醋酸铅溶液，混合均匀，无 菌分装试管达5~6cm高，立即浸入冷水中，使冷凝成琼脂高层。 方法：用接种针蘸取纯培养物，沿管壁作穿刺，孵有于37℃1~2天后观察，必要时可 延长5~7天。培养基变黑色者为阳性
方法：以接种环接种待试细菌的新鲜斜面培养物于邓亨氏蛋白胨溶液中， 37℃培养 24～48 小时后（可延长 4～5 天）。于培养液中加入戊醇或二甲苯 2～3ml，摇匀，静置片刻 后，沿试管壁加入试剂 2 毫升。在戊醇或二甲苯下面的液体变红色者为阳性反应。 也可将一指头大的脱脂棉，滴上两滴欧立希氏试剂，再在同处加滴两滴高硫酸钾 （K2S2O4）饱和水溶液，置于含培养液的被检试管中，离液面约半寸，置烧杯内水浴煮沸为 止，脱脂棉上出现红色为阳性。此法略繁，但省试剂且准确，因为将试剂加到液体中，吲哚 和粪臭素均呈阳性，而用此法，只是吲哚（它能挥发）呈阳性反应。 亦可以滤纸片浸湿 1%的二甲基苯丙烯甲醛的 10％浓 HCl 溶液，然后以接种环刮取一环 琼脂的纯培养物涂布于该滤纸上。 细菌涂印周围呈蓝色者为阳性，细菌涂印周围无色泽变化或淡黄色者为阴性。 厌氧菌用蛋白胨水 蛋白胨 20g 葡萄糖 10g 硫乙醇酸钠 1g Na2HPO4（无水） 2g 琼脂 1g 蒸馏水 1000ml 加热溶解，调整 pH 至 7.4～7.6，过滤，分装小试管，15 磅高压 15 分钟。 七、硫化氢试验 原理：有些细菌能分解含硫氨基酸，产生硫化氢（H2S），H2S 会使培养基中的醋酸铅或 氯化铁形成黑色的硫化铅或硫化铁。 方法 1：醋酸铅琼脂法 培养基： 肉汤琼脂 100ml 10％硫代硫酸钠溶液（新配） 2.5ml 10％醋酸铅溶液 3ml 三种成份分别高压灭菌，前二者混合后待凉至 60℃，加入醋酸铅溶液，混合均匀，无 菌分装试管达 5～6cm 高，立即浸入冷水中，使冷凝成琼脂高层。 方法：用接种针蘸取纯培养物，沿管壁作穿刺，孵育于 37℃ 1～2 天后观察，必要时可 延长 5～7 天。培养基变黑色者为阳性
或将细菌培养于肉汤、肝浸汤琼脂斜面或血清葡萄糖琼脂斜面，在试管的棉花塞下方挂 约6.5×0.6cm2的浸蘸饱和醋酸铅溶液(10g酯酸铅溶于50毫升沸蒸馏水中即成)且己干 燥的滤纸条，于37℃培养，观察7天，纸条变黑者为阳性结果 方法2：三化铁明胶培养基法 培养基 硫胨(Thiopeptone) 25g 明胶 120g 牛肉膏 7.5g 氯化钠 5g 蒸馏水加至 1000ml 上述成份灭菌后趁热加入5ml灭菌的10%氯化铁溶液。立即以无菌操作分装试管，达 5~6cm高，迅速冷凝成高层。 方法：穿刺接种，培养于37℃观察7天，培养基变黑色者为阳性 八、硝酸盐还原试验 原理：有的细菌能把硝酸盐还原为亚硝酸盐，而亚硝酸盐能和对氨基苯磺酸作用生成为 重氮基苯磺酸，且对重氮基苯磺酸与α-萘胺作用能生成红色的化合物Nα-萘胺偶氮苯磺 酸，其反应式为： NO,+HO,S-《NH:+H-→H0,S-《>-N=N+H,O 对氨基苯磺酸 对重氨基苯磺酸 HOS-N=N+ -NH -HO,S-N-N- -NH: 》 a一萘胺 N-a一蔡胺偶氮苯磺酸 (一)适用于需氧菌的方法 培养基： 硝酸钾（不含NO2- 0.2g 蛋白鹏 5g 蒸馏水 1000ml 溶解，调节pH至7.4，分装试管。每管约5毫升，15磅高压灭菌15分钟。 试剂： 甲液对位氨基苯磺酸 08e 5N酷酸溶液 100ml 乙液 a一葵胺 0.5g 5N醋酸溶液 100ml 方法： 接种细菌后37℃培养4天，沿管壁加入甲液二滴与乙液二滴，当时视察。阳性者立刻 呈红色。 (二)厌氧菌硝酸盐培养基法 培养基： 硝酸钾（不含NO2-,化学纯）1g
或将细菌培养于肉汤、肝浸汤琼脂斜面或血清葡萄糖琼脂斜面，在试管的棉花塞下方挂 一约 6.5×0.6cm2 的浸蘸饱和醋酸铅溶液（10g 醋酸铅溶于 50 毫升沸蒸馏水中即成）且已干 燥的滤纸条，于 37℃培养，观察 7 天，纸条变黑者为阳性结果。 方法 2：三氯化铁明胶培养基法 培养基： 硫胨（Thiopeptone） 25g 明胶 120g 牛肉膏 7.5g 氯化钠 5g 蒸馏水加至 1000ml 上述成份灭菌后趁热加入 5ml 灭菌的 10％氯化铁溶液。立即以无菌操作分装试管，达 5～6cm 高，迅速冷凝成高层。 方法：穿刺接种，培养于 37℃观察 7 天，培养基变黑色者为阳性。 八、硝酸盐还原试验 原理：有的细菌能把硝酸盐还原为亚硝酸盐，而亚硝酸盐能和对氨基苯磺酸作用生成对 重氮基苯磺酸，且对重氮基苯磺酸与α-萘胺作用能生成红色的化合物 N-α-萘胺偶氮苯磺 酸，其反应式为： 对氨基苯磺酸 对重氮基苯磺酸 （一）适用于需氧菌的方法 培养基： 硝酸钾（不含 NO2-） 0.2g 蛋白胨 5g 蒸馏水 1000ml 溶解，调节 pH 至 7.4，分装试管。每管约 5 毫升，15 磅高压灭菌 15 分钟。 试剂： 甲液 对位氨基苯磺酸 0.8g 5N 醋酸溶液 100ml 乙液 α—萘胺 0.5g 5N 醋酸溶液 100ml 方法： 接种细菌后 37℃培养 4 天，沿管壁加入甲液二滴与乙液二滴，当时观察。阳性者立刻 呈红色。 （二）厌氧菌硝酸盐培养基法 培养基： 硝酸钾（不含 NO2-，化学纯） 1g