实验一质粒的制备 质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具 有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。 质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集 和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提 过程。 一、实验目的：学握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。 二、实验材料：含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液，克隆有水稻外源片段 的BAC的大肠杆菌菌液。 三、实验原理：在pH12.0~12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体 DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将 pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的 RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状 态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质 粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 四、实验步骤： 1.取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37℃过夜培养： 2.用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37℃ 摇床，250rmim过夜培养： 3.吸取1.5ml菌液，12000g离心2分钟，收集菌体，倒掉菌液：吸取1.5ml 菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净： 4.加入300μ1溶液1振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底 打匀沉淀或碎块)： 5.加入300μ1溶液Ⅱ，轻柔颠倒混匀，放置至消亮，一般不超过5分钟： 6.加入300μ1溶液Ⅲ颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀 7.12000g离心10分钟： 8.畈取800μ1上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管 中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟： 9.12000g常温腐心15分钟：
10.倒尽上清，加75%乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心3分钟后倒去上清）： 11.室温放置或超净台上风干DNA: 12.加40μ1灭菌超纯水或TE溶解： 13.质粒、BAC的质量检测，于20℃保存 实验二DNA的琼脂糖凝胶电泳 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛， 它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其 操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。 一、实验目的：掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学习琼脂糖凝胶电泳的操作。 二、实验材料：质粒DNA、BAC、植物总DNA或它们的酶切产物。 三、实验原理：在pH值为8.0~83时，核酸分子碱基儿乎不解离，磷酸全 部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为 电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现 较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染 料（如EB后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 四、实验步骤： 1,用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上 2.调整好梳子的高度： 3.称取0.24g琼脂糖于30ml0.5×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全 溶解，冷却至45-50℃时倒入制胶板中： 4.凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带： 5.将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中： pUC185μ1+ddH203μ1+溴酚蓝2μ1共10u1于0.5 ml tube中混合后 点样 6.将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动： 7.电冰完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5μg/ml的溴化乙锭(EB)溶液 中染色10一15mi,消水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录
实验三外源DNA片段在质粒载体中的克隆 DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及 纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DNA片 段的克隆技术是分子操作的核心部分。 一、实验目的：学习DNA的酶切、纯化及外源片段与载体的连接，将BAC克 隆所携带的外源DNA酶切片段亚克隆到pUCI8载体上。 二、实验材料：外源片段来自一个含有水稻DNA片段的BAC克隆的酶切片 段，克隆载体为PUC18。 三、实验原理：限制性内切酶可识别特定位点并切割DNA产生粘性末端或平 端的外源片段，经DNA的纯化处理后用于连接反应：选择克隆载体pUCI8多 克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连：在连 接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。 四、实验步骤： 1.载体pUCI8和外源DNA片段的限制性酶切： (50μ1反应体系，用1.5 ml tube,冰上操作) DNA 30l R.E 1 10×buffer5l ddH20 144 37℃反应1hr,分别取8μ1外源片段酶切产物和5μ1PUC18酶切产物 于1.0%凝胶检测酶切是否完全：按2一5步纯化、回收DNA 2.加入dd20150μ1（扩大体积），加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)，颠 倒混匀，12000g离心10min: 3.吸取上清，加1/10体积3 M NaAc和两倍体积无水乙醇，-20℃放置15分 钟以上： 4.12000g4℃冷冻离心15分钟： 5.倒去上消，用75%乙醇浸洗沉淀，风干后外源DNA溶于10μ1ddH20 (0.5 ml tube中)，PUC18溶于20μ1ddH20(1.5 ml tube中)：
6.按以下反应去除载体PUC18的5'磷酸基团，50℃反应30min以上 DNA 20l CIAP TaKaRa 0.5μ1 10xbuffer 4.0l ddH20 15.54l 7.70℃水浴10min,使CIAP失活： 8.按2一5步纯化载体，溶于10μ1ddH20: 9.连接反应(15μ1体系)： DNA 10ul pUC18 2.5l 5xbuffer 1.5l T4 ligase(3U/Hl) 1ul 16℃水浴过夜 10.转化大肠杆菌感受态细胞 11.转化子的鉴定 实验四感受态细胞的制备 体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受 体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了 不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CC12法将外 源DNA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaC2感受态 细胞。 一、实验目的：学习感受态细胞的制备过程 二、实验材料：大肠杆菌菌株DH5a或DH1OB 三、实验原理：对于电转化法，因利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷 的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的 导电离子。109~1010转化子/μgDNA: 对于热激法，是利用冰冷的CaC2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产 生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。106~107转化子/μgDNA
·CaC2感受态细胞的制备的实验步骤 1.前夜接种受体菌(DH5a或DH10B),挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床 培养过夜（约16小时）： 2.取1ml过夜培养物转接于100mlLB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养 约2.5-3小时(250-300pm): 3.将0.1MCaC12溶液置于冰上预冷： 以下步骤需在超净工作台和冰上操作 4.吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟： 5.4℃下3000g冷冻离心5分钟： 6.弃去上清，加入100μ1顶冷0.1MCaC2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀， 使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟： 7.4℃下3000g冷冻离心5分钟： 8.弃去上清，加入100μ1顶冷0.1MCaC2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀， 使细胞重新悬浮： 9.细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂(15%-20%甘油)后超 低温冷冻贮存备用（一70℃）。 ·电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤 1.前夜接种受体菌(DH5a或DH10B),挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床 培养过夜： 2.取2ml过夜培养物转接于200mlLB培养基中，在37℃摇床上刷烈振荡培养 至0D600-0.6(约2.5-3小时)： 3.将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作 4.吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟： 5.4℃下3000g冷冻离心5分钟： 6.弃去上清，加入1500μ1冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使 细胞重新悬浮： 7.4℃下3000g冷冻离心5分钟