物镜介质样品20mmminiumideaolvablox1020mmx102AmX100520minionmrenolvablex10SWOminamronreicolveble103mm10eum-10°nm分辨极限（limitofresolution）：对可见光来说，能清楚分辨出相邻两点之间的最小间隔为0.2um。R=0.612/N.Sina/2=0.61x0.5um/1.5x1=0.2um数值孔径N.A(N.Sina/2)：数值孔径的大小代表了光镜的会聚能力。数值孔径越高，光镜的分辨力越大，所呈影像的亮度越强。随堂练习显微镜的分辨率与放大倍数无关（V）光学显微镜可以直接用于观察单细胞生物或体外培养的细胞。如果观察生物组织样品，则需要对样品进行一定的处理。细胞20-30um厚，没法直接看，涉及到标本的制备问题，切片。生物样品的制备过程：①固定：可使生物大分子交联，蛋白质成分凝固，防止细胞自溶和破坏而产生人工假象（保持生活状况下的情景）。常用固定剂：甲醛、戊二醛、乙醇②包埋：为了便于切片，防止样品移位（石蜡融化了后，包埋在石蜡里，做成蜡块）常用包埋剂：石蜡③切片：由于生物样品太厚，不能直接用光镜观察，需切成1-10um的薄片（再对蜡块进行修理，用切片机切片，刀头上下往返运动）④细胞不同成分的选择性染色（切片展在载玻片上，脱蜡、透明处理后，进行染色）
分辨极限（limit of resolution）：对可见光来说，能清楚分辨出相邻两点之间的最小间隔 为 0.2µm。 R=0.61λ/N.Sinα/2=0.61х0.5µm/1.5х1=0.2µm 数值孔径 N.A(N.Sinα/2):数值孔径的大小代表了光镜的会聚能力。数值孔径越高，光镜 的分辨力越大，所呈影像的亮度越强。 随堂练习 显微镜的分辨率与放大倍数无关（√） 光学显微镜可以直接用于观察单细胞生物或体外培养的细胞。如果观察生物组织样 品，则需要对样品进行一定的处理。细胞 20-30µm 厚，没法直接看，涉及到标本的制备 问题，切片。 生物样品的制备过程： ①固定：可使生物大分子交联，蛋白质成分凝固，防止细胞自溶和破坏而产生人工假象 （保持生活状况下的情景）。常用固定剂：甲醛、戊二醛、乙醇 ②包埋：为了便于切片，防止样品移位（石蜡融化了后，包埋在石蜡里，做成蜡块） 常用包埋剂：石蜡 ③切片：由于生物样品太厚，不能直接用光镜观察，需切成 1-10µm 的薄片（再对蜡块 进行修理，用切片机切片，刀头上下往返运动） ④细胞不同成分的选择性染色（切片展在载玻片上，脱蜡、透明处理后，进行染色）
细胞总重量的70%是水，对可见光来说几乎是透明的，因此未经处理的细胞在普通光镜下几乎是看不见的，为使细胞成为可见的常用方法就是染色。常用的染料：苏木精---对负电荷分子有亲和力，可显示细胞内核酸的分布（蓝紫色）；伊红-可使细胞质染色（红色）。（生物体细胞里的元素C，H，O，N，原子核系数都比较低，没染色时与照射光成像，背景差非常弱，看不清楚，为了增加反差对片子进行染色，染料与周围没染色的背景之间有一个比较大的反差，才能更好地去观察，光学显微镜下观察的切片都需要染色，样本是死的）染色取材固定包埋切片观察石蜡切片的制备程序2、相差显微镜技术（phase-contrastmicroscope）和微分干涉显微镜技术（differential-interferencemicroscope)只有光线通过染色体标本时其波长、振幅发生变化，人眼才能看见，但活细胞和未染色的标本由于光波长和振幅不发生变化，人眼看不到，但其相位有变化，因此利用光的干涉和衍射效应把透过标本不同区域的光波程差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比。个振幅时间A振幅时间=初始光东干涉光（两束光波之间的相互干涉；A：相位相同时，振幅增强，亮光B：相位相反时，振幅减弱，暗光）（相位：描述信号波形变化的度量）相差显微镜（phase-contrastmicroscope）：一种将相位差转变成振幅差（明暗差）的显微镜，可观察不染色的活细胞。微分干涉显微镜（differential-interferencemicroscope）：一种将样品厚度上的微小区别转化成明暗区别相差显微镜
细胞总重量的 70%是水，对可见光来说几乎是透明的，因此未经处理的细胞在普通光镜 下几乎是看不见的，为使细胞成为可见的常用方法就是染色。 常用的染料：苏木精-对负电荷分子有亲和力，可显示细胞内核酸的分布(蓝紫色）； 伊红-可使细胞质染色（红色）。 （生物体细胞里的元素 C，H，O，N， 原子核系数都比较低，没染色时与照射光成 像，背景差非常弱，看不清楚，为了增加反差对片子进行染色，染料与周围没染色的背 景之间有一个比较大的反差，才能更好地去观察，光学显微镜下观察的切片都需要染 色，样本是死的） 2、相差显微镜技术（phase-contrast microscope）和微分干涉显微镜技术（differentialinterference microscope） 只有光线通过染色体标本时其波长、振幅发生变化，人眼才能看见，但活细胞和未染 色的标本由于光波长和振幅不发生变化，人眼看不到，但其相位有变化，因此利用光的 干涉和衍射效应把透过标本不同区域的光波程差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间 呈现清晰可见的明暗对比。 （两束光波之间的相互干涉；A：相位相同时，振幅增强，亮光 B: 相位相反时，振 幅减弱，暗光）（相位：描述信号波形变化的度量） 相差显微镜 （phase-contrast microscope）：一种将相位差转变成振幅差（明暗差）的显 微镜，可观察不染色的活细胞。 微分干涉显微镜（differential-interference microscope）：一种将样品厚度上的微小区别转 化成明暗区别相差显微镜
PhaseContrastLightPathwaysPhase-RingDeflectedLightObjectiveSpecimenCondenserAnnularRingLightFromFigure1Sourcecondenser聚光器：specimen样品：deflectedlight偏离的光相差显微镜比普通光镜多了2个部件：（1）在聚光器上增加一个环形光阑（annulardiaphragm）：位于光源与聚光器之间（一个光圈，只有光圈的能透过，其他地方的光都被挡住了）（2）在物镜后焦面增加一个相板（annularphaseplate），相板上有一个环形区，通过环形区的光比从其他区域透过的光超前或滞后1/42，这样就使通过标本不同区域光波的相位差转变为振幅差。（光源和聚光器之间有一个光阑（选择某些光通过，某些光被挡住了），经过样本时，通过标本的各个局部的力度不一样，就会产生光波相位的改变，光波相位的改变，代表了光波振幅的改变，振幅是代表光的明暗度的，振幅越大，光越亮，振幅越小，光就越弱，（染料染色时，在样品上的沉积不同，光照到样品上后，对光波的吸收情况不同，改变的是光的波长，哪些波被吸收了，哪些波过去了，因此光波波长的改变是颜色的改变）；相位的改变是亮度的改变：目镜里还有一个特殊的相板，把相位改变后的光聚集在一起S
condenser 聚光器；specimen 样品；deflected light 偏离的光 相差显微镜比普通光镜多了 2 个部件：（1）在聚光器上增加一个环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间（一个光圈，只有光圈的能透过，其他地方的光都 被挡住了）（2）在物镜后焦面增加一个相板（annular phaseplate），相板上有一个环形区， 通过环形区的光比从其他区域透过的光超前或滞后 1/4λ，这样就使通过标本不同区域光 波的相位差转变为振幅差。 （光源和聚光器之间有一个光阑（选择某些光通过，某些光被挡住了），经过样本时， 通过标本的各个局部的力度不一样，就会产生光波相位的改变，光波相位的改变，代表 了光波振幅的改变，振幅是代表光的明暗度的，振幅越大，光越亮，振幅越小，光就越 弱，（染料染色时，在样品上的沉积不同，光照到样品上后，对光波的吸收情况不同，改 变的是光的波长，哪些波被吸收了，哪些波过去了，因此光波波长的改变是颜色的改变）； 相位的改变是亮度的改变；目镜里还有一个特殊的相板，把相位改变后的光聚集在一起）
光波的衍射光波的干涉（同一点光源发射，相位相同或相反）相位相同，则振幅增强，亮光；相位相反，则振幅减弱，暗光源。请平肉饮装招然大叶光相差星做德的光路图光通过标本致密区时发生衍射，产生偏折光，相位和未受影响的直射光相比被推迟了1/42（经过样品后，直射光比偏折光超前了1/42的周期）。只有未发生偏折的直射光可通过相位板的环形区，其它的偏折光在物镜的后焦面上产生了一个与通过相位板的环形区的光不同的1/42的光程差。两组光在平面上成像。如相板的环形区使直射光超前1/42，加上开始直射光超前的1/42，直射光共超前1/2入，直射光和偏折光叠加形成的合成波振幅减少，产生暗反差。如相板的环形区使直射光滞后1/42，加上开始直射光超前的1/42，两者相抵直射光不发生变化，直射光和偏折光无相位变化，形成的合成波振幅增加，产生明反差。结果未经染色的活细胞内的各种组织就可显现不同的明暗对比。用途：可以观察未染色的活细胞相差显微镜可观察活细胞的各种运动，如细胞迁移、分裂、运动等。甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态
光波的衍射 光波的干涉（同一点光源发射，相位相同或相反） 相位相同，则振幅增强，亮光；相位相反，则振幅减弱，暗光源。 光通过标本致密区时发生衍射，产生偏折光，相位和未受影响的直射光相比被推迟了 1/4λ（经过样品后，直射光比偏折光超前了 1/4λ 的周期）。只有未发生偏折的直射光可 通过相位板的环形区，其它的偏折光在物镜的后焦面上产生了一个与通过相位板的环形 区的光不同的 1/4λ 的光程差。两组光在平面上成像。 如相板的环形区使直射光超前 1/4λ，加上开始直射光超前的 1/4λ，直射光共超前 1/2λ，直射光和偏折光叠加形成的合成波振幅减少，产生暗反差。 如相板的环形区使直射光滞后 1/4λ，加上开始直射光超前的 1/4λ，两者相抵直射光 不发生变化，直射光和偏折光无相位变化，形成的合成波振幅增加，产生明反差。 结果未经染色的活细胞内的各种组织就可显现不同的明暗对比。 用途：可以观察未染色的活细胞 相差显微镜可观察活细胞的各种运动，如细胞迁移、分裂、运动等。甚至研究细胞核、 线粒体等细胞器的动态
AB体外培养的MDCK细胞的图像·A：普通显微镜所拍·B：相差显微镜所拍光线在通过密度不同的介质时，其滞留程度不同，即产生了光程差和相位差。相差显微镜的基本原理把光程差变成振幅差（即明暗）。从而提高样品反差，故样品不需染色，适合观察活细胞。甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态。它在结构上与普通显微镜最大的不同是在物镜后装有相差板。随堂练习关于相差显微镜的叙述，下列正确的是（ABC）A.用于观察活细胞和未染色的生物标本B细胞各部分细微结构的折射率和厚度不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化（振幅差），这种振幅差肉眼无法观察C，相差显微镜通过改变相位差，并利用光的衍射和干涉现象，把相位差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本D.可以用于超微结构的观察3.微分干涉显微镜微分干涉显微镜用的是偏振光，偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器。1952年，Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强
体外培养的 MDCK 细胞的图像 • A：普通显微镜所拍 • B：相差显微镜所拍 光线在通过密度不同的介质时，其滞留程度不同，即产生了光程差和相位差。相差显 微镜的基本原理把光程差变成振幅差(即明暗)。从而提高样品反差，故样品不需染色，适 合观察活细胞。甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态。它在结构上与普通显微镜最 大的不同是在物镜后装有相差板。 随堂练习 关于相差显微镜的叙述，下列正确的是（ABC） A. 用于观察活细胞和未染色的生物标本 B. 细胞各部分细微结构的折射率和厚度不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变 化，仅相位发生变化（振幅差），这种振幅差肉眼无法观察 C. 相差显微镜通过改变相位差，并利用光的衍射和干涉现象，把相位差变为振幅差 来观察活细胞和未染色的标本 D. 可以用于超微结构的观察 3. 微分干涉显微镜 微分干涉显微镜用的是偏振光，偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化 成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器。 1952 年，Nomarski 发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显 示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强