四、氨基酸的理化性质 1.两性解离与等电点 依照 Bronsted- Lowry的酸碱质子理论,酸是质子(r')供体( donor),碱是质子的受体( acceptor)。酸碱 的相互关系如下: HA=A +H 酸碱质子 这里原始的酸(HA)和生成的碱(A)被称为共轭酸碱对。 根据这一理论,氨基酸在水中的偶极离子既起酸(质子供体)的作用 也起碱(质子受体)的作用 COo + H NH3 NH 同一个氨基酸分子上带有能释放出质子的NH正离子和能接受质子的COO负离子,是两性离子。氨基 酸具有两性解离的特点,因此是两性电解质。 完全质子化的氨基酸可以看成是多元酸,侧链不能解离的中性氨基酸可看作是二元酸,酸性氨基酸和碱性 氨基酸可视为三元酸。现以甘氨酸为例说明氨基酸的解高情况。它分步解高如下: COOH COO 阳离子 兼性离子 K=⊥R"IH IR+ COO H+h 兼性离子 阴离子 (R) I RIIH'I 在上列公式中,K1和K2分别代表α-碳原子上的COO和NH的表观解离常数。如果侧链R基上有可解 离的基团,其表观解离常数用K"表示。 氨基酸的带电状况与溶液的pH值有关,改变pH值可以使氨基酸带上正电荷或负电荷,也可以使它处于正 负电荷数相等即净电荷为零的兼性离子状态。氨基酸处于净电荷为零时溶液的pH值,称为该氨基酸的等电点 isoelectric point,缩写为p。在等电pH值时,氨基酸在电场中既不向正极也不向负极移动,即处于兼性离子 极少数为中性分子状态,少数离子成阳离子和阴离子,但解离成阳离子和阴离子的数目相等 对侧链R基不解高的中性氨基酸来说,其等电点是它的pk1和p的算术平均值 p=÷(pK1+pk2) 在等电点以上的任何p值,氨基酸带净负电荷,并因此在电场中向正极移动。在低于等电点的任 值,氨基酸带有净正电荷,在电场中向负极移动。在一定pH值范围内,氨基酸溶液的pH值离等电点越远, 氨基酸所携带的净电荷越大 20种基本氨基酸,除组氨酸外,在生理pH值(pH值为7左右)下都没有明显的缓冲容量。因为这些氨基酸 的pK值都不在pH值7附近(表38),而缓冲容量只在接近pk值时才显现出来。从表38和图3-2可见,组氨 酸咪唑基的pKn值为60,在pH值为7附近有明显的缓冲作用
37 四、氨基酸的理化性质 1．两性解离与等电点 依照 Bronsted - Lowry 的酸碱质子理论，酸是质子(H＋ )供体（donor），碱是质子的受体（acceptor）。酸碱 的相互关系如下： HA＝A －＋H ＋ 酸 碱 质子 这里原始的酸（HA）和生成的碱（A -）被称为共轭酸-碱对。 根据这一理论，氨基酸在水中的偶极离子既起酸（质子供体）的作用： R C H N +H3 COO _ NH2 + H + R C H COO _ 也起碱（质子受体）的作用。 R C H N +H3 COO _ N +H3 + H + R C H COOH 同一个氨基酸分子上带有能释放出质子的-NH3 ＋正离子和能接受质子的-COO－负离子，是两性离子。氨基 酸具有两性解离的特点，因此是两性电解质。 完全质子化的氨基酸可以看成是多元酸，侧链不能解离的中性氨基酸可看作是二元酸，酸性氨基酸和碱性 氨基酸可视为三元酸。现以甘氨酸为例说明氨基酸的解离情况。 它分步解离如下： (R + ) N +H C H 3 COOH _ + H + H 阳离子 N +H C H 3 COO H 兼性离子 R 0 K1 ' K1 ' = R 0 H + R + (3.1) (R - ) NH C H 2 COO _ + H + H 阴离子 N +H C H 3 COO H 兼性离子 R 0 K2 ' _ K2 ' = H + R 0 R - (3.2) 在上列公式中，K′1 和 K′2 分别代表α-碳原子上的-COO－和-N ＋H3 的表观解离常数。如果侧链 R基上有可解 离的基团，其表观解离常数用 K′R表示。 氨基酸的带电状况与溶液的 pH 值有关，改变 pH 值可以使氨基酸带上正电荷或负电荷，也可以使它处于正 负电荷数相等即净电荷为零的兼性离子状态。氨基酸处于净电荷为零时溶液的 pH 值，称为该氨基酸的等电点 (isoelectric point，缩写为 pI)。在等电 pH 值时，氨基酸在电场中既不向正极也不向负极移动，即处于兼性离子 (极少数为中性分子)状态，少数离子成阳离子和阴离子，但解离成阳离子和阴离子的数目相等。 对侧链 R 基不解离的中性氨基酸来说，其等电点是它的 pKl′和 pK2′的算术平均值。 pI = 1 2 (pK1 ' + pK2 ') 在等电点以上的任何 pH 值，氨基酸带净负电荷，并因此在电场中向正极移动。在低于等电点的任一 pH 值，氨基酸带有净正电荷，在电场中向负极移动。在一定 pH 值范围内，氨基酸溶液的 pH 值离等电点越远， 氨基酸所携带的净电荷越大。 20 种基本氨基酸，除组氨酸外，在生理 pH 值(pH 值为 7 左右)下都没有明显的缓冲容量。因为这些氨基酸 的 pK′值都不在 pH 值 7 附近(表 3-8)，而缓冲容量只在接近 pK′值时才显现出来。从表 3-8 和图 3-2 可见，组氨 酸咪唑基的 pK′R 值为 6.0，在 pH 值为 7 附近有明显的缓冲作用
表3-8氨基酸的表观解离常数和等电点 氨基 pk’(-0OH) pKz'(-NHs) pKR(R一基团) 甘氨酸 缬氨酸 亮氨酸 异亮氨酸 苏氨酸 2. 43 6.53 天冬氨酸 3.86(B-0OH) 天冬酰胺 2.02 5.41 谷氨配 2.19 9.67 4.25(y-0O0H) 3.22 谷氨酰胺 精氨酸 12.48(胍基 10.76 赖氨酸 10.53(c-NH) 1.82 9.17 6.00(咪唑基 7.69 半胱氨酸 10.78(—SH 甲硫氨酸 苯丙氨酸 13 5.48 酪氨酸 10.07(—OH) 色氨酸 甫氨酸 0.60 6.30 注:除半胱氨酸是30℃时的测定值外,其他氨基酸都是25℃时的测定值 2.吸收光谱 参与蛋白质组成的20种氨基酸,在可见光区域都没有光吸收,但在远紫外区域(<20nm均有光吸收。在 近紫外区域(20~300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。因为它们的R基含有苯环共轭双 键系统。酪氨酸的最大光吸收波长在275mm,苯丙氨酸的在257mm,色氨酸的在280m。 蛋白质由于含有这些氨基酸,因此也有紫外吸收能力。一般最大光吸收在波长280m处,因此利用分光光度 法能很方便地测定蛋白质的含量。但是在不同的蛋白质中这些氨基酸的含量不同,所以它们的消光系数(或称 吸收系数)是不完全一样的 3.除甘氨酸外都具有旋光性 4.重要化学反应 氨基酸的化学反应主要是指它的氨基和a羧基以及侧链上的功能团所参与的那些反应。 (1)与亚硝酸反应在室温下亚硝酸能与含游离a-氨基的氨基酸起反应,定量地放出氮气,氨基酸被 R—CH-COoH+HNO2 R—CH- COOH+N2↑+H2O 氧化成羟酸(含亚氨基的脯氨酸则不能与亚硝酸反应)。其反应式如下: 在标准条件下测定生成的氮气体积,即可计算出氨基酸的量,用此方法反应很快,也较为准确,是定量测 定氨基酸的方法之一(此反应是 Vanslyke氨基氮测定法的基础)。此法还可用于蛋白质水解程度的测定 这里值得注意的是生成的氮气cN)只有一半来自氨基酸。此外应该指出,除aNH外,赖氨酸的ε-NH也 能与亚硝酸反应,但速度较慢。而α-N作用3~4min即完成反应。 (2)与2,4二硝基氟苯的反应在弱碱性溶液中,氨基酸的α-氨基很容易与2,4-二硝基氟苯 (DNFB)作用,生成稳定的黄色2,4二硝基苯基氨基酸(简写为DNP氨基酸)。 O,N' +H2NCH一COOH CH--COOH He (NFB DNP氨基酸(黄色) 这个反应首先被 英国的 Sanger用来鉴定多肽或蛋白质的N末端氨基酸。 (3)与异硫氰酸苯酯反应在弱碱性条件下,氨基酸中的α-氨基还可以与异硫氰酸苯酯(PIC)反 应,产生相应的苯氨基硫甲酰氨基酸(PIC氨基酸)。在无水酸中,PI℃-氨基酸即环化为苯硫乙内酰脲(PIH)
38 表 3-8 氨基酸的表观解离常数和等电点 注：除半胱氨酸是 30℃时的测定值外，其他氨基酸都是 25℃时的测定值。 2．吸收光谱 参与蛋白质组成的 20种氨基酸，在可见光区域都没有光吸收，但在远紫外区域(＜220 nm 均有光吸收。在 近紫外区域(220～300 nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。因为它们的 R 基含有苯环共轭双 键系统。酪氨酸的最大光吸收波长在 275 nm，苯丙氨酸的在 257 nm，色氨酸的在 280 nm。 蛋白质由于含有这些氨基酸，因此也有紫外吸收能力。一般最大光吸收在波长 280 nm 处，因此利用分光光度 法能很方便地测定蛋白质的含量。但是在不同的蛋白质中这些氨基酸的含量不同，所以它们的消光系数（或称 吸收系数）是不完全一样的。 3．除甘氨酸外都具有旋光性 4．重要化学反应 氨基酸的化学反应主要是指它的-氨基和α-羧基以及侧链上的功能团所参与的那些反应。 （1）与亚硝酸反应 在室温下亚硝酸能与含游离α-氨基的氨基酸起反应，定量地放出氮气，氨基酸被 氧化成羟酸(含亚氨基的脯氨酸则不能与亚硝酸反应)。其反应式如下： 在标准条件下测定生成的氮气体积，即可计算出氨基酸的量，用此方法反应很快，也较为准确，是定量测 定氨基酸的方法之一（此反应是Vanslyke 氨基氮测定法的基础）。此法还可用于蛋白质水解程度的测定。 这里值得注意的是生成的氮气(N2)只有一半来自氨基酸。此外应该指出，除α-NH2 外，赖氨酸的ε-NH2 也 能与亚硝酸反应，但速度较慢。而α-NH2 作用 3～4min 即完成反应。 （2）与 2，4-二硝基氟苯的反应 在弱碱性溶液中，氨基酸的α- 氨基很容易与 2，4-二硝基氟苯 （DNFB）作用，生成稳定的黄色 2，4-二硝基苯基氨基酸（简写为 DNP-氨基酸）。 F NO2 O2N CH COOH R N NO2 O2N H CH COOH R + H2N 弱碱中 + HF (DNFB) DNP-氨基酸（黄色） 这个反应首先被 英国的 Sanger 用来鉴定多肽或蛋白质的 N 末端氨基酸。 （3）与异硫氰酸苯酯反应 在弱碱性条件下，氨基酸中的α-氨基还可以与异硫氰酸苯酯（PITC）反 应，产生相应的苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸）。在无水酸中，PTC-氨基酸即环化为苯硫乙内酰脲（PTH）， 氨基酸 pK1′（-COOH） pK2′（-NH3） pKR′(R—基团) pI 甘氨酸 2.34 9.60 5.97 丙氨酸 2.34 9.69 6.02 缬氨酸 2.32 9.62 5.97 亮氨酸 2.36 9.60 5.98 异亮氨酸 2.36 9.68 6.02 丝氨酸 2.21 9.15 5.68 苏氨酸 2.63 10.43 6.53 天冬氨酸 2.09 9.82 3.86(β-COOH) 2.97 天冬酰胺 2.02 8.8 5.41 谷氨酸 2.19 9.67 4.25(γ-COOH) 3.22 谷氨酰胺 2.17 9.13 5.65 精氨酸 2.17 9.04 12 .48（胍基） 10.76 赖氨酸 2.18 8.95 10 .53（ε-NH2） 9.74 组氨酸 1.82 9.17 6 .00( 咪唑基) 7.59 半胱氨酸 1.71 8.33 10 .78( —SH) 5.02 甲硫氨酸 2.28 9.21 5.75 苯丙氨酸 1.83 9.13 5.48 酪氨酸 2.20 9.11 10 .07(—OH) 5.66 色氨酸 2.38 9.39 5.89 脯氨酸 1.99 10.60 6.30 R CH NH2 COOH R CH OH + HNO2 COOH+ N2 + H2O