启动子 启动子的可控性 乳糖启动子P的可控性 CAMP 高效转录 野生型的P上游附近拥有 CAP 代谢激活因子(CAP)结 区,CAMP激活CAP,CAP 结合启动子控制区,进而促 葡萄糖代谢 CAMP浓度降低 进尸。介导的转录。葡萄糖 基底水平转录 代谢使cAMP减少,也能阻 遏Pa介导的转录。因此, 基因工程中使用的乳糖启动 高效转录 子均为抗葡萄糖代谢阻遏的 突变型,即P lac UV5 lac Uv5
启动子 启动子的可控性 启动子的可控性 Plac Plac 乳糖启动子 乳糖启动子PPlac lac的可控性： 的可控性： OO Plac Plac OO 高效转录 高效转录 葡萄糖代谢 葡萄糖代谢 野生型的 野生型的PPlaclac上游附近拥有 上游附近拥有 代谢激活因子（ 代谢激活因子（CAP CAP）结合 ）结合 区，区，cAMP cAMP激活激活CAP CAP，，CAP CAP 基底水平转录 基底水平转录 结合启动子控制区，进而促 结合启动子控制区，进而促 进进PPlaclac介导的转录。葡萄糖 介导的转录。葡萄糖 代谢使 代谢使cAMP cAMP减少，也能阻 减少，也能阻 遏遏PPlaclac介导的转录。因此， 介导的转录。因此， 基因工程中使用的乳糖启动 基因工程中使用的乳糖启动 子均为抗葡萄糖代谢阻遏的 子均为抗葡萄糖代谢阻遏的 突变型，即 突变型，即Plac UV5 Plac UV5 CAP CAP cAMP cAMP cAMP cAMP浓度降低 浓度降低 Plac UV5 Plac UV5 OO 高效转录 高效转录
启动子 启动子的可控性 色氨酸 基底水平转录 色氨酸启动子P的可控性:阻遏蛋白 色氨酸启动子P受色氨酸阻遏 蛋白复合物的阻遏,转录呈基底除去色氨酸 或加3-吲哚丙烯酸 状态。在培养系统中去除色氨酸 (IAA) 或者加入3吲哚丙烯酸(IAA) 高效转录 便可有效地解除阻遏抑制作用。 在正常的细菌培养体系中,除去 色氨酸是困难的,因此基因工程 中往往添加AA诱导P介导的目 高效转录 基因的表达
启动子 启动子的可控性 启动子的可控性 Ptrp Ptrp 色氨酸启动子 色氨酸启动子PPtrptrp的可控性： 的可控性： OOtrptrp 除去除去色氨酸 色氨酸 色氨酸启动子 色氨酸启动子PPtrptrp受色氨酸 受色氨酸--阻遏阻遏 蛋白复合物的阻遏，转录呈基底 蛋白复合物的阻遏，转录呈基底 状态。在培养系统中去除色氨酸 状态。在培养系统中去除色氨酸 基底水平转录 基底水平转录 或者加入 或者加入3-3-吲哚丙烯酸 吲哚丙烯酸（（IAA IAA），）， 便可有效地解除阻遏抑制作用。 便可有效地解除阻遏抑制作用。 在正常的细菌培养体系中，除去 在正常的细菌培养体系中，除去 色氨酸是困难的，因此基因工程 色氨酸是困难的，因此基因工程 中往往添加 中往往添加IAA IAA诱导诱导PPtrptrp介导的目 介导的目 基因的表达 基因的表达 色氨酸 色氨酸 或加或加3-3-吲哚丙烯酸 吲哚丙烯酸 高效转录 高效转录 阻遏蛋白 阻遏蛋白 （（IAA IAA）） Ptrp OOtrptrp Ptrp 高效转录 高效转录 Ptrp OOtrptrp Ptrp
启动子 启动子的可控性 阻遏作用 λ噬菌体启动子P的可控性 目的基因 噬菌体启动子P受C阻遏蛋白阻 遏,很难直接诱导控制。在基因 工程中常使用温度敏感型的c戾 变基因cl5控制P。Cl阻遏蛋 在42时失活脱落,P便可介导 目的基因的表达。但在大型细菌 色氨酸 培养罐中迅速升温非常困难,因m N·表达 此常使用一个双质粒控制系统, B 用色氨酸间接控制目的基因表达
启动子 启动子的可控性 启动子的可控性 λλ噬菌体启动子 噬菌体启动子PPλλLL的可控性： 的可控性： 噬菌体启动子 噬菌体启动子PPLL受受CI CI阻遏蛋白阻 阻遏蛋白阻 遏，很难直接诱导控制。在基因 遏，很难直接诱导控制。在基因 工程中常使用温度敏感型的 工程中常使用温度敏感型的cI cI突突 变基因cI857控制PL。 cI 变基因cI857控制PL。 cI857 857阻遏蛋 阻遏蛋 在在4242℃时失活脱落， ℃时失活脱落，PPLL便可介导 便可介导 目的基因的表达。但在大型细菌 目的基因的表达。但在大型细菌 培养罐中迅速升温非常困难，因 培养罐中迅速升温非常困难，因 此常使用一个双质粒控制系统， 此常使用一个双质粒控制系统， 用色氨酸间接控制目的基因表达 用色氨酸间接控制目的基因表达 Ptrp Ptrp AA BB cI857 cI857 PL PL 目的基因 目的基因 阻遏作用 阻遏作用 Ptrp Ptrp AA BB PL PL 色氨酸 色氨酸 表达表达
终止子 强化转录终止的必要性 外源基因在强启动子的控制下表达,容易发生转录过头现象,即RNA聚合酶滑 过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列,形成长短不一的mRNA混合物 过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达,其原因如下: 转录产物越长,RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加,外源基因 本身的转录效率下降; ●如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域,如选择性标 记基因和复制子结构等,则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生 物功能,甚至导致重组质粒的不稳定性; ●过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质,增加工程菌无谓的能量消耗 ●更为严重的是,过长的转录物往往不能形成理想的二级结构,从而大大降低外源 基因编码产物的翻译效率
终止子 强化转录终止的必要性 强化转录终止的必要性 外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑 过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物 过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因 本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标 记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生 物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源 基因编码产物的翻译效率 外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑 过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物 过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因 本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标 记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生 物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源 基因编码产物的翻译效率
终止子 强终止子的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终 止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的 mT72以及T7噬菌体DNA上的7。对 于一些终止作用较弱的终止子,通常 pCP1 可以采用二聚体终止子串联的特殊结 构,以增强其转录终止作用 终止子也可以象启动子那样,通过 特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因筛选Ap、Tc的转化子 组DNA中克隆筛选
终止子 强终止子的选择与使用 强终止子的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终 止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的 rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tφ。对 于一些终止作用较弱的终止子，通常 可以采用二聚体终止子串联的特殊结 构，以增强其转录终止作用 终止子也可以象启动子那样，通过 特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因 组DNA中克隆筛选 目前外源基因表达质粒中常用的终 止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的 rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tφ。对 于一些终止作用较弱的终止子，通常 可以采用二聚体终止子串联的特殊结 构，以增强其转录终止作用 终止子也可以象启动子那样，通过 特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因 组DNA中克隆筛选 ApAprr pCP1 pCP1 ori ori Tc Tcrr 筛选Apr、Tc 筛选Apr、Tcss的转化子 的转化子