6外源基因在大肠杆菌中的表达 B外源基因在大肠杄菌中高效表达的原理 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 ●质粒拷贝数
B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 6 外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在大肠杆菌中的表达 启动子 启动子 终止子 终止子 核糖体结合位点 核糖体结合位点 密码子 密码子 质粒拷贝数 质粒拷贝数
启动子 目的基因 启动子最佳距离的探测 目的基因 A酶切开 启动子 Ba31酶解
启动子 启动子最佳距离的探测 启动子最佳距离的探测 目的基因 目的基因 EE EE AA EE EE 启动子 启动子 A A 酶切开 酶切开 Bal31 Bal31酶解酶解 目的基因 目的基因
启动子 启动子的筛选 = 采用鸟枪法战略,将合适大小的DNA片段 终止密码子 克隆到启动子探针质粒pKO1上 Ap 受体细胞染色体DNA上的ga/、gaT与质 pKo 粒上报告基因gk的表达产物联合作用, or 可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质 转化gat、ga冖、gaK的大肠杆菌受体菌株 含有外源启动子活性的重组克隆
启动子 启动子的筛选动筛 Ap Aprr ori ori pKO1 pKO1 galK galK 采用鸟枪法战略，将合适大小的 采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA DNA片段片段 终止密码子 终止密码子 克隆到启动子探针质粒 克隆到启动子探针质粒pKO1 pKO1上上 受体细胞染色体 受体细胞染色体DNA DNA上的上的galE galE、、galT galT与质与质 粒上报告基因 粒上报告基因galk galk的表达产物联合作用， 的表达产物联合作用， 可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质 可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质 转化galE+、galT+、galK 转化galE+、galT+、galK--的大肠杆菌受体菌株 的大肠杆菌受体菌株 含有外源启动子活性的重组克隆 含有外源启动子活性的重组克隆
启动子 启动子的构建 启动子 -35区序列 -10区序列 PGA A G AT CT recA GA A traA A CA AATGT trp IGAC A TA A CT ac AC A tac GA A ATA A tac =3 Ptrp =11 Plac
启动子 启动子的构建动构 -35 -35 区序列 区序列 -10 -10 区序列 区序列 PPλλLL PPrecA recA PPtrptrp PPlac lac PPtraA traA PPtac tac 启动子 启动子 T T G A C A T T G A C A G A T A C T G A T A C T T T G A T A T T G A T A T A T A A T T A T A A T T T G A C A T T G A C A T T A A C T T T A A C T T A G A C A T A G A C A T A A T G T T A A T G T T T T A C A T T T A C A T A T A A T T A T A A T T T G A C A T T G A C A T A T A A T T A T A A T PPtac tac = 3 Ptrp = 11 Plac = 3 Ptrp = 11 Plac
启动子 启动子的可控性 基底水平转录 乳糖启动子P的可控性 阻遏蛋白 野生型的Pac与其控制区Oa 偶联在一起,在没有诱导物 存在时,整个操纵子处于基乳糖异丙基β-D-硫 代半乳糖苷(|PTG) 诱导 底水平表达;诱导物可以使 启动子P介导的转录大幅 二份)《 二)《 高效转录 提高
启动子 启动子的可控性 启动子的可控性 PP 乳糖启动子 乳糖启动子PPlac lac的可控性： 的可控性： OO PP OO 高效转录 高效转录 阻遏蛋白 阻遏蛋白 诱导诱导 乳糖 异丙基-β-D-硫 代半乳糖苷（IPTG） 乳糖 异丙基-β-D-硫 代半乳糖苷（IPTG） 野生型的 野生型的Plac与其控制区Olac Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物 偶联在一起，在没有诱导物 存在时，整个操纵子处于基 存在时，整个操纵子处于基 基底水平转录 基底水平转录 底水平表达；诱导物可以使 底水平表达；诱导物可以使 启动子 启动子PPlaclac介导的转录大幅 介导的转录大幅 提高提高