07/22/2005QPM06/03/20006/03/2004
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CRISPRClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats成簇的，规律间隔的，短回文重复序列CRISPR-Cas9基因定点修饰w2Cn2919199CrRNaeGRSP向重这序进化中细菌与病毒斗争产生的免疫武器
CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats 成簇的，规律间隔的，短回文重复序列 进化中细菌与病毒斗争 产生的免疫武器
发现与结构特点1987年日本科学家：细菌中存在很多成簇的、规律间隔的，短回文重复序列（CRISPR序列）富含AT的leaderregion，为启动子序列茎环结构为向导RNA（gRNA）250times550bpleaderFulllengthtranscript26-72NtspacehomologouswithphageDNA病毒入侵，被寄主捕捉，并产生免疫记忆，当含有相似序列的外源DNA再次入侵时，可被细菌机体识别，进行剪切，使之表达沉默，达到保护自身的目的
CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats），也称“规律成簇间隔短回文重复”，是细菌在抵御病毒侵 染的进化历程中形成的一种免疫武器，用以保护自身对抗病毒的一种防御系统。这一系统经过改造修饰，目前已在删除、添 加、激活或抑制其他生物体的目标基因方面得到广泛应用。 1987年日本科学家发现在细菌中存在很多成簇的、规律间隔的，短回文重复序列（CRISPR序列），全长转录本包含一段约 300-550bp，富含AT的前导区(leader region)，也是CRISPR序列的启动子序列，随后有约250次左右重复的、短且高度保守的重 复序列区(repeat)，每个重复单位约有21-50bp的回文序列，可形成发卡状的茎环结构（stem－loop），也称这一茎环结构为向 导RNA（gRNA），每个重复单位间有20-70个bp的间隔区(spacer)。这一间隔区的序列由被俘获的外源DNA组成，类似免疫记 忆，当含有同样序列的外源DNA再次入侵时，可被细菌机体识别，并进行剪切，使之表达沉默，达到保护自身的目的。如图 7-17A。 对CRISPR簇侧翼序列的研究发现，在其附近存在一个多态性的基因家族。该家族编码的基因分别含有核酸酶、解旋酶、整 合酶和聚合酶等活性的功能域，并且与CRISPR区域共同发挥作用，因此被命名为CRISPR关联基因(CRISPR associated)，缩写 为Cas。Cas基因与CRISPR同步进化，共同构成一个高度保守的防御系统。目前发现的CRISPR/Cas系统有I型、II型和III型等三 种类型，它们存在于大约40%已测序的真细菌和90%已测序的古细菌中。在II型中以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心组成 的系统较为简单，是目前研究最为深入的类型。 当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时，在前导区的调控下，CRISPR被转录为长的前体RNA (Pre CRISPR RNA，pre-crRNA)， 同时，与crRNA序列互补的反式激活crRNA(Trans-activating crRNA，tracrRNA)也转录出来， tracrRNA与Cas9， RNase III核酸 酶共同对pre-crRNA进行加工， 使其成为短的仅含有一个重复序列单位和间隔区的成熟crRNA。加工成熟后的crRNA与 tracrRNA，Cas9组成复合体，在外来DNA中的前间隔邻接基序（Protospacer Adjacent Motif .PAM）NGG特征序列的上游，识 别并结合与其间隔序列互补的外源DNA序列，解开DNA双链，形成R-loop，使crRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单 链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链， RuvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂 (DSB)。如图7-17B。 26-72Nt space homologous with phage DNA 茎环结构为向导RNA（gRNA） 病毒入侵，被寄主捕捉，并产生免疫记忆，当含有相似序列的外源DNA再次入 侵时，可被细菌机体识别，进行剪切，使之表达沉默，达到保护自身的目的。 富含AT的leader region，为启动子序列 1987年日本科学家： 细菌中存在很多成簇的、规律间隔的，短回文重复序列（CRISPR序列） 发现与结构特点
解旋酶、在CRISPR族侧翼序列附近，存在分别编码有核酸酶、整合酶和聚合酶等活性的功能域的多基因家族。与CRISPR区域共同发挥作用，构成一个高度保守的防御系统(CRISPR关联基因，CRISPRassociated，Cas。在已发现的、Ⅱ和川型中，以I型的CRISPR-Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA为核心组成的系统研究最为深入。5-TS
CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats），也称“规律成簇间隔短回文重复”，是细菌在抵御病毒侵 染的进化历程中形成的一种免疫武器，用以保护自身对抗病毒的一种防御系统。这一系统经过改造修饰，目前已在删除、添 加、激活或抑制其他生物体的目标基因方面得到广泛应用。 1987年日本科学家发现在细菌中存在很多成簇的、规律间隔的，短回文重复序列（CRISPR序列），全长转录本包含一段约 300-550bp，富含AT的前导区(leader region)，也是CRISPR序列的启动子序列，随后有约250次左右重复的、短且高度保守的重 复序列区(repeat)，每个重复单位约有21-50bp的回文序列，可形成发卡状的茎环结构（stem－loop），也称这一茎环结构为向 导RNA（gRNA），每个重复单位间有20-70个bp的间隔区(spacer)。这一间隔区的序列由被俘获的外源DNA组成，类似免疫记 忆，当含有同样序列的外源DNA再次入侵时，可被细菌机体识别，并进行剪切，使之表达沉默，达到保护自身的目的。如图 7-17A。 对CRISPR簇侧翼序列的研究发现，在其附近存在一个多态性的基因家族。该家族编码的基因分别含有核酸酶、解旋酶、整 合酶和聚合酶等活性的功能域，并且与CRISPR区域共同发挥作用，因此被命名为CRISPR关联基因(CRISPR associated)，缩写 为Cas。Cas基因与CRISPR同步进化，共同构成一个高度保守的防御系统。目前发现的CRISPR/Cas系统有I型、II型和III型等三 种类型，它们存在于大约40%已测序的真细菌和90%已测序的古细菌中。在II型中以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心组成 的系统较为简单，是目前研究最为深入的类型。 当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时，在前导区的调控下，CRISPR被转录为长的前体RNA (Pre CRISPR RNA，pre-crRNA)， 同时，与crRNA序列互补的反式激活crRNA(Trans-activating crRNA，tracrRNA)也转录出来， tracrRNA与Cas9， RNase III核酸 酶共同对pre-crRNA进行加工， 使其成为短的仅含有一个重复序列单位和间隔区的成熟crRNA。加工成熟后的crRNA与 tracrRNA，Cas9组成复合体，在外来DNA中的前间隔邻接基序（Protospacer Adjacent Motif .PAM）NGG特征序列的上游，识 别并结合与其间隔序列互补的外源DNA序列，解开DNA双链，形成R-loop，使crRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单 链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链， RuvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂 (DSB)。如图7-17B。 在CRISPR簇侧翼序列附近，存在分别编码有核酸酶、解旋酶、 整合酶和聚合酶等活性的功能域的多基因家族。 与 CRISPR区域共同发挥作用，构成一个高度保守的防御系统 （CRISPR关联基因，CRISPR associated，Cas。 在已发现的I、II和III型中， 以II型的CRISPR－Cas9 蛋白以及向导RNA(gRNA) 为核心组成的系统研究最 为深入
当噬菌体等入侵细菌时，在leadingseq.的调控下，CRISPR被转录为PreCRISPRRNA（pre-crRNA)250times550bpleaderFulllengthtranscript被crRNA序列反式激活的，并能与其互补的Trans-activatingcrRNA，tracrRNA转录出来，与Cas9，RNaseIⅢ核酸酶共同对pre-crRNA进行加工，短的仅含有一个重复序列单位和间隔区的成熟crRNA被cascade状地加工形成。ProcessingbyCascadecomplexLLLCrRNAS
CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats），也称“规律成簇间隔短回文重复”，是细菌在抵御病毒侵 染的进化历程中形成的一种免疫武器，用以保护自身对抗病毒的一种防御系统。这一系统经过改造修饰，目前已在删除、添 加、激活或抑制其他生物体的目标基因方面得到广泛应用。 1987年日本科学家发现在细菌中存在很多成簇的、规律间隔的，短回文重复序列（CRISPR序列），全长转录本包含一段约 300-550bp，富含AT的前导区(leader region)，也是CRISPR序列的启动子序列，随后有约250次左右重复的、短且高度保守的重 复序列区(repeat)，每个重复单位约有21-50bp的回文序列，可形成发卡状的茎环结构（stem－loop），也称这一茎环结构为向 导RNA（gRNA），每个重复单位间有20-70个bp的间隔区(spacer)。这一间隔区的序列由被俘获的外源DNA组成，类似免疫记 忆，当含有同样序列的外源DNA再次入侵时，可被细菌机体识别，并进行剪切，使之表达沉默，达到保护自身的目的。如图 7-17A。 对CRISPR簇侧翼序列的研究发现，在其附近存在一个多态性的基因家族。该家族编码的基因分别含有核酸酶、解旋酶、整 合酶和聚合酶等活性的功能域，并且与CRISPR区域共同发挥作用，因此被命名为CRISPR关联基因(CRISPR associated)，缩写 为Cas。Cas基因与CRISPR同步进化，共同构成一个高度保守的防御系统。目前发现的CRISPR/Cas系统有I型、II型和III型等三 种类型，它们存在于大约40%已测序的真细菌和90%已测序的古细菌中。在II型中以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心组成 的系统较为简单，是目前研究最为深入的类型。 当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时，在前导区的调控下，CRISPR被转录为长的前体RNA (Pre CRISPR RNA，pre-crRNA)， 同时，与crRNA序列互补的反式激活crRNA(Trans-activating crRNA，tracrRNA)也转录出来， tracrRNA与Cas9， RNase III核酸 酶共同对pre-crRNA进行加工， 使其成为短的仅含有一个重复序列单位和间隔区的成熟crRNA。加工成熟后的crRNA与 tracrRNA，Cas9组成复合体，在外来DNA中的前间隔邻接基序（Protospacer Adjacent Motif .PAM）NGG特征序列的上游，识 别并结合与其间隔序列互补的外源DNA序列，解开DNA双链，形成R-loop，使crRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单 链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链， RuvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂 (DSB)。如图7-17B。 当噬菌体等入侵细菌时， 在leading seq.的调控下，CRISPR被转录为Pre CRISPR RNA (pre-crRNA) 被crRNA序列反式激活的，并能与其互补的Trans-activating crRNA，tracrRNA转 录出来，与Cas9，RNase III核酸酶共同对pre-crRNA进行加工， 短的仅含有一个 重复序列单位和间隔区的成熟crRNA被cascade状地加工形成