实验二:微生物细胞大小与数量的测定 实验目的与要求: (1)了解显微镜测定微生物大小与血球计数板测定微生物数量的原理。 (2)学习并掌握显微镜下测定微生物细胞大小的技术,包括目镜测微尺、物镜测微尺的 校正技术与测定细胞大小的技术 (3)了解血球计数板的结构,学习并掌握血球计数板计数微生物数量的技术,包括样品 的点样、菌数计数的方法与计算。 、实验原理 1.微生物大小测定原理 微生物细胞的大小,是微生物重要的形态特征之一,也是分类鉴定的依据之一。由于菌体很 小、只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺 目镜测微尺(图20-1)是一块圆形玻片,在玻片中央把5mm长度刻成50等分,或把10mm长度 刻成100等分。测量时,将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量 经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同,目镜测微尺每格实际 表示的长度也不一样,因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正 以求出在一定放大倍数下,目镜测微尺每小格所代表的相对长度 镜台测微尺(图20-2)是中央部分刻有精确等分线的载玻片,一般将1mm等分为100格,每 格长10μm(即0.01m),是专门用来校正目镜测微尺的。校正时,将镜台测微尺放在载物台上, 图20-1目镜测微尺 由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置,都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野,即 镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大,因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真 实大小,所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺,即可求出目镜测微尺 每格所代表的长度,然后移去镜台测微尺,换上待测标本片,用校正好的目镜测微尺在同样放大 倍数下测量微生物大小。 2.血球计数板测定微生物数量的原理 镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液,如有杂菌或杂质常不易分辨。菌体较 大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球计数板:一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽( Petroff Hausser)细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同,只是细菌计数板较薄,可以使用油镜 观察。而血球计数板较厚,不能使用油镜,故细菌不易看清 血球计数板是一块特制的厚载玻片,载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较 宽,其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个方格网(图Ⅳ-2)。每个方格网 共分9大格,其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种
实验二：微生物细胞大小与数量的测定 一、实验目的与要求： （1） 了解显微镜测定微生物大小与血球计数板测定微生物数量的原理。 （2） 学习并掌握显微镜下测定微生物细胞大小的技术，包括目镜测微尺、物镜测微尺的 校正技术与测定细胞大小的技术。 （3） 了解血球计数板的结构，学习并掌握血球计数板计数微生物数量的技术，包括样品 的点样、菌数计数的方法与计算。 二、实验原理 1. 微生物大小测定原理 微生物细胞的大小，是微生物重要的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。由于菌体很 小、只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。 目镜测微尺（图 20-1）是一块圆形玻片，在玻片中央把 5mm 长度刻成 50 等分，或把 10 mm 长度 刻成 100 等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量 经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际 表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正， 以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 镜台测微尺（图 20-2）是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将 lmm 等分为 100 格，每 格长 l0μm（即 0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上， 图 20-1 目镜测微尺 由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即 镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真 实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺 每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大 倍数下测量微生物大小。 2. 血球计数板测定微生物数量的原理 镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质常不易分辨。菌体较 大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球计数板；一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(Petroff Hausser)细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜 观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。 血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有 4 条槽而构成 3 个平台。中间的平台较 宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网(图Ⅳ-2)。每个方格网 共分 9 大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：
种是大方格分为16个中方格,而每个中方格又分成25个小方格;另一种是一个大方格分 成25个中方格,而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造,它们都 有一个共同特点,即每个大方格都由400个小方格组成(图5)。 每个大方格边长为1mm,则每一大方格的面积为1m2,每个小方格的面积为1/400mm2 盖上盖玻片后,盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm,所以每个计数室(大方格)的体积 为0.1mm,每个小方格的体积为1/4000m3。使用血球计数板直接计数时,先要测定每个小 方格(或中方格)中微生物的数量,再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。 0.1 cOmm 400mm 图Ⅳ-2血球计数扳的构造 a.平面图(中间平台分为两半,各刻有一个方格网) b.侧面图(中间平台与盖玻片之间有高度为0.1毫米的间隙) 图Ⅳ-3血球计数板计数网的分区和分格 三、实验器材 1、仪器显微镜,目镜测微尺,镜台测微尺,血球计数板、盖玻片(22mm×22mm)、吸水 、计数器、滴管、擦镜纸 2、材料酵母菌液 四、实验方法 1.目镜测微尺的校正把目镜的上透镜旋下,将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目 镜的隔板上,把镜台测微尺置于载物台上,刻度朝上。先用低倍镜观察,对准焦距,视野中看清
一种是大方格分为 16 个中方格，而每个中方格又分成 25 个小方格；另一种是一个大方格分 成 25 个中方格，而每个中方格又分成 16 个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都 有一个共同特点，即每个大方格都由 400 个小方格组成(图 5)。 每个大方格边长为 1mm，则每一大方格的面积为 1mm2，每个小方格的面积为 1／400mm2， 盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为 0.1mm，所以每个计数室(大方格)的体积 为 0.1mm3，每个小方格的体积为 l／4000mm3。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小 方格(或中方格)中微生物的数量，再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。 图Ⅳ-2 血球计数扳的构造 a.平面图(中间平台分为两半，各刻有一个方格网) b.侧面图(中间平台与盖玻片之间有高度为 0.1 毫米的间隙) 图Ⅳ-3 血球计数板计数网的分区和分格 三、实验器材 1、 仪器 显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、吸水 纸、计数器、滴管、擦镜纸 2、 材料 酵母菌液 四、实验方法 1．目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目 镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清
镜台测微尺的刻度后,转动目镜,使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行,移动推动器,使两尺 重叠,再使两尺的“0”刻度完全重合,定位后,仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度(图20-3), 计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长10 um,所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度 例如目镜测微尺5小格正好与镜台测微尺5小格重叠,已知镜台测微尺每小格为10μm,则目镜 测微尺上每小格长度为=5×10μm/5=10um 用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同,因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和 附件(特定的物镜、目镜、镜筒长度)进行,而且只能在特定的情况下重复使用,当更换不同放 大倍数的日镜或物镜时,必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。 2.细胞大小的测定 (1)将酵母菌斜面制成一定浓度的菌悬液(10-2) (2)取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片。 (3)移去镜台测微尺,换上酵母菌水浸片,先在低倍镜下找到目的物,然后在高倍镜下用 目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长,宽各占几格(不足一格的部分估计到小数点后一位数)。测 出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值,即等于该菌的长和宽。一般测量菌体的大小要在同一个 标本片上测定10—20个菌体,求出平均值,才能代表该菌的大小。而且一般是用对数生长期的 菌体进行测定。 3.细菌数量的测定 (1)取洁净的血球计数板一块,在计数室上盖上一块盖玻片。 (2)将酵母菌液摇匀,用滴管吸取少许,从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘 滴入一小滴(不宜过多),使菌液沿两玻片间自行渗入计数室,勿使产生气泡,并用吸水纸吸 去沟槽中流出的多余菌液。也可以将菌液直接滴加在计数室上,然后加盖盖玻片(勿使产生 气泡)。 (3)静置约5分钟,先在低倍镜下找到计数室后,再转换高倍镜观察计数 (4)计数时用16中格的计数板,要按对角线方位,取左上、左下、右上、右下的4个中格(即 100小格)的酵母菌数。如果是25中格计数板。除数上述四格外,还需数中央1中格的酵母 菌数(即80小格)。由于菌体在计数室中处于不同的空间位置,要在不同的焦距下才能看到 因而观察时必须不断调节微调螺旋,方能数到全部菌体,防止遗漏。如菌体位于中格的双线 上,计数时则数上线不数下线,数左线不数右线,以减少误差。 (5)凡酵母菌的芽体达到母细胞大小一半时,即可作为两个菌体计算。每个样品重复分数2-3 次(每次数值不应招差过大,否则应重新操作),取其平均值,按下述公式计算出每毫升菌液 所含酵母菌细胞数 每毫升菌液含菌数=每小格酵母细胞数×4000×1000×稀释倍数 (6)血球计数板用后,在水龙头上用水柱冲洗干净,切勿用硬物洗刷或抹擦,以免损坏网格 刻度。洗净后自行晾干或吹风机吹干 五、实验报告 将实验结果填入下列表格 表 镜测微目尺校正结果 镜 目尺格数台尺格数日尺校正值(um) 10× 100 表20-2酵母菌大小测定记录(格)
镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺 重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度(图 20-3)， 计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长 l0 μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。 例如目镜测微尺 5 小格正好与镜台测微尺 5 小格重叠，已知镜台测微尺每小格为 l0μm，则目镜 测微尺上每小格长度为=5×10μm/5＝10μm 用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和 附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放 大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。 2．细胞大小的测定 (1)将酵母菌斜面制成一定浓度的菌悬液（10-2） (2)取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片。 (3)移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用 目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测 出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。一般测量菌体的大小要在同一个 标本片上测定 10—20 个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。而且一般是用对数生长期的 菌体进行测定。 3. 细菌数量的测定 (1)取洁净的血球计数板一块，在计数室上盖上一块盖玻片。 (2)将酵母菌液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘 滴入一小滴(不宜过多)，使菌液沿两玻片间自行渗入计数室，勿使产生气泡，并用吸水纸吸 去沟槽中流出的多余菌液。也可以将菌液直接滴加在计数室上，然后加盖盖玻片(勿使产生 气泡)。 (3)静置约 5 分钟，先在低倍镜下找到计数室后，再转换高倍镜观察计数。 (4)计数时用 16 中格的计数板，要按对角线方位，取左上、左下、右上、右下的 4 个中格(即 100 小格)的酵母菌数。如果是 25 中格计数板。除数上述四格外，还需数中央 1 中格的酵母 菌数(即 80 小格)。由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到， 因而观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部菌体，防止遗漏。如菌体位于中格的双线 上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。 (5)凡酵母菌的芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复分数 2-3 次(每次数值不应招差过大，否则应重新操作)，取其平均值，按下述公式计算出每毫升菌液 所含酵母菌细胞数。 每毫升菌液含菌数＝每小格酵母细胞数×4000×1000×稀释倍数 (6)血球计数板用后，在水龙头上用水柱冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格 刻度。洗净后自行晾干或吹风机吹干。 五、实验报告 将实验结果填入下列表格 表 20-1 目镜测微目尺校正结果 物镜 目尺格数 台尺格数 目尺校正值（μm） 10× 40× 100× 表 20-2 酵母菌大小测定记录 （格）
123456789101112131415平均值 结果计算长μ皿=平均格数×校正值 宽μm=平均格数×校正值 大小表示:宽μm×长m 计数次数 每个大方格菌数 式管斜面中的总平均值 菌数 第一次 第二次 思考题 (1)根据你的体会,说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面?应如何尽量减少 误差、力求准确? (2)某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率,请设计1-2种可行的检测方法
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 平均值 长 宽 结果计算 长μm＝平均格数×校正值 宽μm＝平均格数×校正值 大小表示：宽μm×长μm 计数次数 每个大方格菌数 稀 释 倍 数 试管斜面中的总 菌数 平均值 1 2 3 4 5 第一次 第二次 思考题 (1)根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面?应如何尽量减少 误差、力求准确? (2)某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计 1—2 种可行的检测方法