实验三:培养基的制备与灭菌 实验目的与要求: (1)熟悉玻璃器皿的洗涤包装和灭菌前的准备工作。 (2)学习微生物培养基和无菌水的制备,了解培养基配方中各成分的作用、制备流程及 各环节的操作技术与应用 (3)学习并掌握培养基的高压蒸气灭菌原理、操作关键技术和灭菌技术。 、实验原理 培养基的制备原理 培养基是按照微生物生长发育的需要,用不同组分的营养物质调制而成的营养基质。人 工制备培养基的目的,在于给微生物创造一个良好的营养条件。把一定的培养基放入一定的 器皿中,就提供了人工繁殖微生物的环境和场所。自然界中,微生物种类繁多,由于微生物 具有不同的营养类型,对营养物质的要求也各不相同,加之实验和研究上的目的不同,所以 培养基在组成原料上也各有差异。但是,不同种类和不同组成的培养基中,均应含有满足微 生物生长发育的水分、碳源、氮源、无机盐和生长素以及某些特需的微量元素等。此外,培 养基还应具有适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力及一定的氧化还原电位和合适的渗透 压 根据制备培养基对所选用的营养物质的来源,可将培养基分为天然培养基、半合成培养 基和合成培养基三类。按照培养基的形态可将培养基分为液体培养基和固体培养基。根据培 养基使用目的,可将培养基分为选择培养基、加富培养基及鉴别培养基等。 培养基的类型和种类是多种多样的,必须根据不同的微生物和不同的目的进行选择配 制,本实验分别配制常用培养细菌、放线菌和真菌的牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号合成培 养基和马铃薯蔗糖培养基等固体培养基。 固体培养基是在液体培养基中添加凝固剂制成的,常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅酸钠, 其中以琼脂最为常用,其主要成份为多糖类物质,性质较稳定,一般微生物不能分解,故用 凝固剂而不致引起化学成份变化。琼脂在95℃的热水中才开始融化,融化后的琼脂冷却到 45℃才重新凝固。因此用琼脂制成的固体培养基在一般微生物的培养温度范围内(25℃-37℃ 不会融化而保持固体状态 高压蒸气灭菌原理 高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内,通过加热,使灭菌锅隔 套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽,然后关闭排气 阀,继续加热,此时由于蒸汽不能溢出,而增加了灭菌器内的压力,从而使沸点增高,得到 高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的 在同一温度下,湿热的杀菌效力比干热大,其原因有三:一是湿热中细菌菌体吸收水 分,蛋白质较易凝固,因蛋白质含水量增加,所需凝固温度降低(表Ⅴ-2),二是湿热的穿透 力比干热大(表V-3):三是湿热的蒸汽有潜热存在,每1克水在100℃时,由气态变为液态 时可放出2.26kJ(千焦)的热量。这种潜热,能迅速提高被灭菌物体的温度,从而増加灭菌 效力。 表V-2蛋白质含水量与凝固所需温度的关系 卵自蛋白含水量(%) 30分钟内凝固所需温度(℃C)
实验三：培养基的制备与灭菌 一、实验目的与要求： （1） 熟悉玻璃器皿的洗涤包装和灭菌前的准备工作。 （2） 学习微生物培养基和无菌水的制备，了解培养基配方中各成分的作用、制备流程及 各环节的操作技术与应用。 （3） 学习并掌握培养基的高压蒸气灭菌原理、操作关键技术和灭菌技术。 二、实验原理 培养基的制备原理 培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组分的营养物质调制而成的营养基质。人 工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。把一定的培养基放入一定的 器皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场所。自然界中，微生物种类繁多，由于微生物 具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究上的目的不同，所以 培养基在组成原料上也各有差异。但是，不同种类和不同组成的培养基中，均应含有满足微 生物生长发育的水分、碳源、氮源、无机盐和生长素以及某些特需的微量元素等。此外，培 养基还应具有适宜的酸碱度(pH 值)和一定缓冲能力及一定的氧化还原电位和合适的渗透 压。 根据制备培养基对所选用的营养物质的来源，可将培养基分为天然培养基、半合成培养 基和合成培养基三类。按照培养基的形态可将培养基分为液体培养基和固体培养基。根据培 养基使用目的，可将培养基分为选择培养基、加富培养基及鉴别培养基等。 培养基的类型和种类是多种多样的，必须根据不同的微生物和不同的目的进行选择配 制，本实验分别配制常用培养细菌、放线菌和真菌的牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号合成培 养基和马铃薯蔗糖培养基等固体培养基。 固体培养基是在液体培养基中添加凝固剂制成的，常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅酸钠， 其中以琼脂最为常用，其主要成份为多糖类物质，性质较稳定，一般微生物不能分解，故用 凝固剂而不致引起化学成份变化。琼脂在 95℃的热水中才开始融化，融化后的琼脂冷却到 45℃才重新凝固。因此用琼脂制成的固体培养基在一般微生物的培养温度范围内(25℃-37℃) 不会融化而保持固体状态。 高压蒸气灭菌原理 高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔 套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气 阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到 高于 100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水 分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低(表Ⅴ-2)，二是湿热的穿透 力比干热大(表Ⅴ-3)；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每 1 克水在 100℃时，由气态变为液态 时可放出 2.26kJ(千焦)的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌 效力。 表Ⅴ-2 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系 卵自蛋白含水量(%) 30 分钟内凝固所需温度(℃)
50 表V-3干热与湿热穿透力及灭菌效果比较 透过布层的温度(℃) 温度(℃) 时间(小时) 灭菌 100 130-140 不完全 湿热105.3 10l 完全 在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时,灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要,因为空气 膨胀压大于水蒸汽的膨胀压,所以,当水蒸汽中含有空气时,在同一压力下,含空气蒸汽的 温度低于饱和蒸汽的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时,压力与温度的关系见表V-4。 般培养基用1.05kg/cm2,121.3℃15-30分钟可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的 时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用0.56kg/cm2(8磅/ 英寸2),112.6℃灭菌15分钟,但为了保证效果,可将其他成分先行121.3℃,20分钟灭菌 然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以1.05kg/cm2,121.3℃ 灭菌20分钟即可,而盛于大瓶内的培养基最好以1.05kg/cm2灭菌30分钟。 表V-4灭菌锅内留有不同分量空气时,压力与温度的关系 压力数 千克 全部空气排|2/3空气排|1/2空气排1/3空气排空气全不排 (公斤/厘米磅英寸2|出时的温度出时的温度出时的温度出时的温度出时的温度 (1b/in2) (℃C) (℃) 0.35 108.8 100 0.70 115.6 109 1.05 15 115 112 109 1.40 126.2 118 115 134.6 126 蒸汽压力所用单位为kg/cm2(千克/厘米2),它与1b/in2(磅/英寸2)和温度的换算关系见 表V 表V-5蒸汽压力与蒸汽温度换算关系 蒸汽压力 压力表读数 蒸汽温度 大气压 kg/cm 1b/i 1.0 0.00 100.0 1.25 0.25 3.75 107.0 0.50 7.50 12.0 1. 0.75 11 115.0
50 25 18 6 0 56 74-80 80-90 145 160-170 表Ⅴ-3 干热与湿热穿透力及灭菌效果比较 温 度 (℃) 时间(小时) 透过布层的温度(℃) 灭 菌 20 层 40 层 100 层 干热 130-140 4 86 72 70.5 不完全 湿热 105.3 3 10l 10l 10l 完 全 在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气 膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的 温度低于饱和蒸汽的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见表Ⅴ-4。一 般培养基用 1.05kg/cm2，121.3℃ 15-30 分钟可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的 时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如含糖培养基用 0.56kg/cm2 (8 磅/ 英寸 2 )，112.6℃灭菌 15 分钟，但为了保证效果，可将其他成分先行 121.3℃，20 分钟灭菌， 然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以 1.05kg/cm2，121.3℃ 灭菌 20 分钟即可，而盛于大瓶内的培养基最好以 1.05kg/cm2 灭菌 30 分钟。 表Ⅴ-4 灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系 压 力 数 全部空气排 出时的温度 (℃) 2/3 空气排 出时的温度 (℃) l/2 空气排 出时的温度 (℃) 1/3 空气排 出时的温度 (℃) 空气全不排 出时的温度 (℃) 千克 (公斤/ 厘米 2 ) (kg/cm2 ) 磅/英寸 2 (1b/in2 ) 0.35 0.70 1.05 1.40 1.75 2.10 5 10 15 20 25 30 108.8 115.6 121.3 126.2 130.0 134.6 100 109 115 121 126 130 94 105 112 118 124 128 90 100 109 115 121 126 72 90 100 109 115 121 蒸汽压力所用单位为 kg/cm2 (千克/厘米 2 )，它与 1b/in2 (磅/英寸 2 )和温度的换算关系见 表Ⅴ-5。 表Ⅴ-5 蒸汽压力与蒸汽温度换算关系 蒸汽压力 大气压 压 力 表 读 数 蒸汽温度 kg/cm2 1b/in2 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 0.00 3.75 7.50 11.25 15.00 100.0 107.0 112.0 115.0 121.0
2.50 1.50 22.50 三、实验器材 1、药品琼脂,10%HCL,10%NaOH,牛肉膏蛋白胨培养基的配方药品; 2、材料具刻度100毫升塘瓷盅或小铝锅,电子称,10×200mm试管,量筒,小烧杯, 玻璃棒,骨匙,皿试纸,分装漏斗,试管盒,纱布,棉花,报纸,麻绳,标签,培养皿。 3、设备高压蒸汽灭菌锅、烘箱、冰箱、电炉等 四、实验步骤 1、称取药品放在大烧杯中,加入蒸馏水用玻璃棒搅拌并加热溶化,等药品溶解后用pH试 纸调节pH至7476,如有沉淀应过滤后分装,每支试管约加入9ml。每组分装30支, 加上棉塞,包上牛皮纸,准备灭菌 装入试管中的量不宜超过试管高度的1/5,装入三角烧瓶中的量以烧瓶总体积的一半为 限。在分装过程中,应注意勿使培养基沾污管口或瓶口、以免弄湿棉塞,造成污染 2、无菌水准备 在试管或瓶内先盛以适量的蒸馏水〔或生理盐水O.85%NaCl),盖好棉塞,包上牛皮 纸使其灭菌后,其水量恰为9ml。每组准备10支与牛肉膏蛋白胨培养基可放在同一试管架 上,以一大张牛皮纸包扎写上姓名。准备灭菌。 3、高压灭菌 手提式高压蒸汽灭菌锅的使用操作步骤: (1)首先将内层灭菌桶取出,再向外层锅内加入适量的水,使水面与三角搁架相平为宜。 (2)放回灭菌桶,并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤,以免防碍蒸汽流通而影响灭 菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触,以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞, (3)加盖,并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时 旋紧相对的两个螺栓,使螺栓松紧一致,勿使漏气。 (4)用电炉或煤气加热,并同时打开排气阀,使水沸腾以排除涡内的冷空气。待冷空气 完全排尽后,关上排气阀,让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需 压力时,控制热源,维持压力至所需时间。本实验用1.05kg/cm2,121.3℃,20分钟灭菌。 (5)灭菌所需时间到后,切断电源或关闭煤气,让灭菌锅内温度自然下降,当压力表的 压力降至0时,打开排气阀,旋松螺栓,打开盖子,取出灭菌物品。如果压力未降到0时, 打开排气阀,就会因锅内压力突然下降,使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶 口或试管口,造成棉塞沾染培养基而发生污染。 (6)将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时,经检查若无杂菌生长,即可待用。 五、思考题 1、棉塞的作用?
2.50 3.00 1.50 2.00 22.50 30.00 128.0 134.5 三、实验器材 1、 药品 琼脂，10％HCL,10% NaOH，牛肉膏蛋白胨培养基的配方药品； 2、 材料 具刻度 1000 毫升塘瓷盅或小铝锅，电子称，10×200mm 试管，量筒，小烧杯， 玻璃棒，骨匙，pH 试纸，分装漏斗，试管盒，纱布，棉花，报纸，麻绳，标签，培养皿。 3、 设备 高压蒸汽灭菌锅、烘箱、冰箱、电炉等 四、实验步骤 1、 称取药品放在大烧杯中，加入蒸馏水用玻璃棒搅拌并加热溶化，等药品溶解后用 pH 试 纸调节 p H 至 7.4-7.6，如有沉淀应过滤后分装，每支试管约加入 9ml。每组分装 30 支， 加上棉塞，包上牛皮纸，准备灭菌。 装入试管中的量不宜超过试管高度的 1/5，装入三角烧瓶中的量以烧瓶总体积的一半为 限。在分装过程中，应注意勿使培养基沾污管口或瓶口、以免弄湿棉塞，造成污染。 2、无菌水准备 在试管或瓶内先盛以适量的蒸馏水〔或生理盐水 O．85％NaCl)，盖好棉塞，包上牛皮 纸使其灭菌后，其水量恰为 9ml。 每组准备 10 支与牛肉膏蛋白胨培养基可放在同一试管架 上，以一大张牛皮纸包扎写上姓名。准备灭菌。 3、高压灭菌 手提式高压蒸汽灭菌锅的使用操作步骤： （1）首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。 （2）放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭 菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。 （3）加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时 旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。 （4）用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除涡内的冷空气。待冷空气 完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需 压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用 1.05kg/cm2，121.3℃，20 分钟灭菌。 （5）灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的 压力降至 0 时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到 0 时， 打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶 口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。 （6）将取出的灭菌培养基放入 37℃温箱培养 24 小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。 五、思考题 1、棉塞的作用？