呼和浩特职业学院教案首页 课 题第二章预处理技术 授课时间 3.11,3.18 授课对象2013级生物技术及应用1、2班授课学时 掌握发酵液预处理的方法 教学目的2.熟悉各种细胞破碎的方法 3.熟悉过滤和离心分离技术 4.了解常见过滤分离设备的特点 教学重点 絮凝、凝聚、过滤、离心 教学难点 絮凝凝聚 教学方法 举例法，图示法，比较法，提问法，作业法等 、 组织教学：点名、检查学生的出勤情况(5min) 二、从发酵液状态导入新课：发酵液不适合过滤，需要改 善发酵液的过滤特性，怎么改？(10min) 教学步骤 三、开始讲授 及 (一)加热、调p、絮凝、凝聚等方法(75min) 内容提要 (二)固液分离，过滤，过滤分类，原理，因素(45min) (三)离心技术，细胞破碎及破碎率计算(35min) 四、总结并习题，结束本次课(10min) 备注
呼和浩特职业学院教案首页 课 题 第二章 预处理技术 授课时间 3.11，3.18 授课对象 2013 级生物技术及应用 1、2 班 授课学时 4 教学目的 1．掌握发酵液预处理的方法 2．熟悉各种细胞破碎的方法 3．熟悉过滤和离心分离技术 4．了解常见过滤分离设备的特点 教学重点 絮凝、凝聚、过滤、离心 教学难点 絮凝 凝聚 教学方法 举例法，图示法，比较法，提问法，作业法等 教学步骤 及 内容提要 一、组织教学:点名、检查学生的出勤情况（5min） 二、从发酵液状态导入新课：发酵液不适合过滤，需要改 善发酵液的过滤特性，怎么改？（10 min） 三、开始讲授 （一）加热、调 pH、絮凝、凝聚等方法（75 min） （二）固液分离,过滤，过滤分类，原理，因素(45 min) （三）离心技术，细胞破碎及破碎率计算（35 min） 四、总结并习题，结束本次课（10 min） 备注
讲授内容： 教学提示 第二章细胞破碎与固液初级分离技术 第一节细胞破碎技术 阐述细胞破碎技术的含义及各种细胞壁的特点 一、机械法 (一)捣碎法 通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000一20000rmin 视频法 的内刀式组织捣碎机（即高速分散器）将组织的细胞打碎，为了防止发热和 提问：温 升温过高，通常是转10一20s,停10一205，可反复多次。 度升高 (二)珠磨法 了，怎么 利用玻璃小珠与细胞悬液一起高速搅拌，带动玻璃小球撞击细胞，作用 控制？ 于细胞壁的碰撞作用和剪切力使细胞破碎。 (三)高压匀浆法 适用于酵母菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和黑曲霉等。 (四)超声波破碎法 利用发射15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。 注意必须 一般认为超声波破碎的机理是：在超声波作用下液体发生空化作用，空 讲行冷 穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。超声波破 却，很重 碎法是很强列的破碎方法，话用于多数微生物的破碎。超声波破碎法的有效 要 能量利用率极低，操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或有外部冷却 的容器中进行。由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，主要用于实验 室规模的细胞破碎。 二、非机械法 (一)冻结-融化法 将细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，此冻结一融化操作反复进行多次， 使细胞受到破坏。 冻结的作用是破坏细胞膜的疏水键结构，增加其亲水性和通透性。另 方面，由于胞内水结晶使胞内外产生溶液浓度差，在渗透压作用下引起细胞 膨胀而破裂。冻结一融化法对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释 放较为有效，但溶质靠分子扩散释放出来，速度缓慢。因此，冻结-融化法在 多数情况下效果不显著。 (二)渗透压冲击法 渗透压冲击是各种细胞破碎法中最为温和的一种，适用于易于破碎的细 胞，如动物细胞和革兰氏阴性菌。 将细胞置于高渗透压的介质（如较高浓度的甘油或蔗糖溶液）中，达到 平衡后，将介质突然稀释或将细胞转置于低渗透压的水或缓冲溶液中。在渗 透压的作用下，水渗透通过细胞壁和膜进人细胞，使细胞壁和膜膨胀破裂。 2
2 讲授内容： 第二章 细胞破碎与固液初级分离技术 第一节 细胞破碎技术 阐述细胞破碎技术的含义及各种细胞壁的特点 一、机械法 （一）捣碎法 通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10 000－ 20 000 r/min 的内刀式组织捣碎机（即高速分散器）将组织的细胞打碎，为了防止发热和 升温过高，通常是转10－20 s，停10—20 s，可反复多次。 （二）珠磨法 利用玻璃小珠与细胞悬液一起高速搅拌，带动玻璃小球撞击细胞，作用 于细胞壁的碰撞作用和剪切力使细胞破碎。 （三）高压匀浆法 适用于酵母菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和黑曲霉等。 （四）超声波破碎法 利用发射 15-25kHz 的超声波探头处理细胞悬浮液。 一般认为超声波破碎的机理是：在超声波作用下液体发生空化作用，空 穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。超声波破 碎法是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。超声波破碎法的有效 能量利用率极低，操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或有外部冷却 的容器中进行。由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，主要用于实验 室规模的细胞破碎。 二、非机械法 （一）冻结-融化法 将细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，此冻结一融化操作反复进行多次， 使细胞受到破坏。 冻结的作用是破坏细胞膜的疏水键结构，增加其亲水性和通透性。另一 方面，由于胞内水结晶使胞内外产生溶液浓度差，在渗透压作用下引起细胞 膨胀而破裂。冻结一融化法对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释 放较为有效，但溶质靠分子扩散释放出来，速度缓慢。因此，冻结-融化法在 多数情况下效果不显著。 （二）渗透压冲击法 渗透压冲击是各种细胞破碎法中最为温和的一种，适用于易于破碎的细 胞，如动物细胞和革兰氏阴性菌。 将细胞置于高渗透压的介质（如较高浓度的甘油或蔗糖溶液）中，达到 平衡后，将介质突然稀释或将细胞转置于低渗透压的水或缓冲溶液中。在渗 透压的作用下，水渗透通过细胞壁和膜进人细胞，使细胞壁和膜膨胀破裂。 教学提示 视频法 提问：温 度升高 了，怎么 控制？ 注意必须 进行冷 却，很重 要
教学提示 (三)有机溶剂法 有机溶剂（如胍、乙醇、尿素和异丙醇等）可以削弱疏水分子间的相互 作用。异丙醇广泛应用于从酵母中分离蛋白酶的细胞破碎工艺中。尽管有机 提问：为 溶剂可以用于任何规模的细胞破碎，但在使用中高浓度的有机溶剂使很多蛋 什么能够 白质（如酶）失活，不适合大规模的生产工艺。 用有机溶 有机溶剂被细胞壁吸收后，会使细胞壁膨胀或溶解，导致破裂，把细胞 剂溶解？ 内产物释放到水相中去。选用溶剂的基本原则是，以与细胞壁中脂质类似的 溶解度参数的溶剂作为细胞破碎的溶剂。 (四)表面活性剂法 表面活性剂是指不仅能溶于水或其他有机溶剂，同时又能在相界面上定 向并改变界面性质的某些有机化合物。表面活性剂分子中同时具有憎水基团 和亲水基团，当表面活性剂溶质或溶剂中的浓度达到一定时，它的分子会产 生凝聚，生成胶束，憎水端向内，亲水端向外。憎水基团聚集在胶束内部 将溶解的脂蛋白包在中心，而亲水基团则向外层，使膜的通透性改变或使细 胞壁溶解，从而使胞内物质释放到水相中。 (五)酸碱法 蛋白质为两性电解质，改变pH可改变其荷电性质，使蛋白质之间或蛋白 质与其他物质之间的相互作用力降低而易于溶解。因此，利用酸碱调节pH值， 可提高目标产物容解度。 (六)酶溶法 利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后， 再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性
3 （三）有机溶剂法 有机溶剂（如胍、乙醇、尿素和异丙醇等）可以削弱疏水分子间的相互 作用。异丙醇广泛应用于从酵母中分离蛋白酶的细胞破碎工艺中。尽管有机 溶剂可以用于任何规模的细胞破碎，但在使用中高浓度的有机溶剂使很多蛋 白质（如酶）失活，不适合大规模的生产工艺。 有机溶剂被细胞壁吸收后，会使细胞壁膨胀或溶解，导致破裂，把细胞 内产物释放到水相中去。选用溶剂的基本原则是，以与细胞壁中脂质类似的 溶解度参数的溶剂作为细胞破碎的溶剂。 （四）表面活性剂法 表面活性剂是指不仅能溶于水或其他有机溶剂，同时又能在相界面上定 向并改变界面性质的某些有机化合物。表面活性剂分子中同时具有憎水基团 和亲水基团，当表面活性剂溶质或溶剂中的浓度达到一定时，它的分子会产 生凝聚，生成胶束，憎水端向内，亲水端向外。憎水基团聚集在胶束内部， 将溶解的脂蛋白包在中心，而亲水基团则向外层，使膜的通透性改变或使细 胞壁溶解，从而使胞内物质释放到水相中。 （五）酸碱法 蛋白质为两性电解质，改变 pH 可改变其荷电性质，使蛋白质之间或蛋白 质与其他物质之间的相互作用力降低而易于溶解。因此，利用酸碱调节 pH 值， 可提高目标产物溶解度。 （六）酶溶法 利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后， 再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。 教学提示 提问：为 什么能够 用有机溶 剂溶解？
第二节固液初级分离技术 教学提示 一、离心分离技术 (一)基本原理 是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固 体顺粒加速沉降的分离过程。 不同密度或不同大小及形状的物质在重力作用下的沉降速率不同，在形 成密度梯度的液相体系中的平衡位置不同。离心分离过程就是以离心力加速 不同物质沉降分离的过程。被分离物质之间必须存在或经人为处理产生的密 度或沉降速率差异才能以离心方法进行分离。离心分离方法中差速离心法操 作最简便，使用最广泛，但其分离纯化分辨率低于密度梯度离心。 (二)离心机 1、离心机分类 可分为工业用离心机和实验用离心机。实验用离心机又分为制备性离心 机和分析性离心机，制备性离心机主要用于分离各种生物材料，每次分离的 结合学生 样品容量比较大，分析性离心机一般都带有光学系统，主要用于研究纯的生 实验课用 物大分子和颗粒的理化性质，依据待测物质在离心场中的行为（用离心机中 到的来讲 的光学系统连续监测)，能推断物质的纯度、形状和分子质量等。分析性离心 解 机都是超速离心机。 (1)制备性离心机可分为三类：①普通离心机②高速冷冻离心机 ③超速离心机 (2)分析性离心机 2、离心机结构 (1)转子 转子是超速离心机的核心设备之一，一般由铝合金或钦合金制成，其制 阐述特点 造工艺要求苛刻，价格昂贵，需特别保养。在转子完好时，对各种转子的使 用时间、次数及转数均有严格规定。转子类型较多，心转子、垂直管转子及 细胞洗脱转子。 让学生结 ①角度转子 合设备课 ②水平转子 上学过的 ③区带转子 知识来解 ④垂直管转子 ⑤连续离心转子 ⑥细胞洗脱转子
4 第二节 固液初级分离技术 一、离心分离技术 （一）基本原理 是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固 体颗粒加速沉降的分离过程。 不同密度或不同大小及形状的物质在重力作用下的沉降速率不同，在形 成密度梯度的液相体系中的平衡位置不同。离心分离过程就是以离心力加速 不同物质沉降分离的过程。被分离物质之间必须存在或经人为处理产生的密 度或沉降速率差异才能以离心方法进行分离。离心分离方法中差速离心法操 作最简便，使用最广泛，但其分离纯化分辨率低于密度梯度离心。 （二）离心机 1、离心机分类 可分为工业用离心机和实验用离心机。实验用离心机又分为制备性离心 机和分析性离心机，制备性离心机主要用于分离各种生物材料，每次分离的 样品容量比较大，分析性离心机一般都带有光学系统，主要用于研究纯的生 物大分子和颗粒的理化性质，依据待测物质在离心场中的行为（用离心机中 的光学系统连续监测），能推断物质的纯度、形状和分子质量等。分析性离心 机都是超速离心机。 （1）制备性离心机可分为三类：① 普通离心机② 高速冷冻离心机 ③ 超速离心机 （2）分析性离心机 2、离心机结构 （1）转子 转子是超速离心机的核心设备之一，一般由铝合金或钦合金制成，其制 造工艺要求苛刻，价格昂贵，需特别保养。在转子完好时，对各种转子的使 用时间、次数及转数均有严格规定。转子类型较多，心转子、垂直管转子及 细胞洗脱转子。 ①角度转子 ②水平转子 ③区带转子 ④垂直管转子 ⑤连续离心转子 ⑥细胞洗脱转子 教学提示 结合学生 实验课用 到的来讲 解 阐述特点 让学生结 合设备课 上学过的 知识来解 答
(2)离心机附件①离心管②密度梯度离心附件③区带离心附件 教学提示 ④分析附件 3、离心机操作的注意事项 (1)使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容 物。 提问法 (2)装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心 液体的性质及体积选用适合的离心管。 (3)若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置 于离心机的转头室内预冷。 (4)离心时程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工 作，如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。 (5)每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时要查阅说明 书，不得过速使用。每一转头都要有一份使用档案，记录累积的使用时间， 若超过了该转头的最高使用限时，则须按规定降速使用。 二、粗滤设备及常用介质 (一)粗滤分离设备 1、板框压滤机 它是由多个滤板和滤框交替重叠排列而组成滤室的一种间歌操作加压 过滤机。滤板两面铺有滤，用压紧装置把滤板和滤框压紧，滤框中的空间构 成过滤的操作空间。在板框的上端开有孔道从第一块滤板一直通到最后一块 图示法 滤框，悬浮液在压力下送入，并由每一块滤框上的支路孔道送入过滤空间。 滤板表面刻有垂直的或纵横交错的浅沟，其下端钻有供液体排出的孔道。滤 液在压力下通过滤布流人滤板表面的浅沟中，顺浅沟往下流，最后汇集于滤 板下端的排液孔道中排出。固体颗粒被滤布截留在滤框中，一定时间后，松 开滤板和滤框，卸除滤渣。 (二)过滤介质 过滤介质是指能使固一液混合料液得以分离的某一介面，通常指滤布或 膜过滤中所用的膜。过滤介质要求能耐酸碱，耐高温，耐化学试剂，抗拉性 能好，有一定的机械强度和孔隙度。常用的滤布材料有法兰绒、帆布、斜纹 布、白细布及一些合成纤维。膜材料主要有醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚砜、 聚酰胺、聚丙烯等。 三、彩响液一固分离的因素 大多数微生物发酵液都属于非牛顿型液体，液一固分离较困难，发酵液 的流变特性与很多因素有关，主要取决于菌种和培养条件。 (一)微生物种类的影响 一般真菌的菌丝比较粗大，液一固分离容易，含真菌菌体及絮凝蛋白质的发 酵液，可采用鼓式真空过滤或板框过滤。对于酵母菌体，离心分离的方法具 有较好的效果。但是细菌或细胞碎片相当细小，液一固分离十分困难， 5
5 （2）离心机附件 ① 离心管② 密度梯度离心附件③ 区带离心附件 ④ 分析附件 3、 离心机操作的注意事项 （1）使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容 物。 （2）装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心 液体的性质及体积选用适合的离心管。 （3）若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置 于离心机的转头室内预冷。 （4）离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工 作，如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。 （5）每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时要查阅说明 书，不得过速使用。每一转头都要有一份使用档案，记录累积的使用时间， 若超过了该转头的最高使用限时，则须按规定降速使用。 二、粗滤设备及常用介质 （一）粗滤分离设备 1、板框压滤机 它是由多个滤板和滤框交替重叠排列而组成滤室的一种间歇操作加压 过滤机。滤板两面铺有滤，用压紧装置把滤板和滤框压紧，滤框中的空间构 成过滤的操作空间。在板框的上端开有孔道从第一块滤板一直通到最后一块 滤框，悬浮液在压力下送入，并由每一块滤框上的支路孔道送入过滤空间。 滤板表面刻有垂直的或纵横交错的浅沟，其下端钻有供液体排出的孔道。滤 液在压力下通过滤布流人滤板表面的浅沟中，顺浅沟往下流，最后汇集于滤 板下端的排液孔道中排出。固体颗粒被滤布截留在滤框中，一定时间后，松 开滤板和滤框，卸除滤渣。 （二）过滤介质 过滤介质是指能使固一液混合料液得以分离的某一介面，通常指滤布或 膜过滤中所用的膜。过滤介质要求能耐酸碱，耐高温，耐化学试剂，抗拉性 能好，有一定的机械强度和孔隙度。常用的滤布材料有法兰绒、帆布、斜纹 布、白细布及一些合成纤维。膜材料主要有醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚砜、 聚酰胺、聚丙烯等。 三、影响液一固分离的因素 大多数微生物发酵液都属于非牛顿型液体，液一固分离较困难，发酵液 的流变特性与很多因素有关，主要取决于菌种和培养条件。 （一）微生物种类的影响 一般真菌的菌丝比较粗大，液一固分离容易，含真菌菌体及絮凝蛋白质的发 酵液，可采用鼓式真空过滤或板框过滤。对于酵母菌体，离心分离的方法具 有较好的效果。但是细菌或细胞碎片相当细小，液一固分离十分困难， 教学提示 提问法 图示法