实验四蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由 Ornstein(1964)和 Davis(1964)设计的,样品和 浓缩胶中含 Tris-HC(pH6.8),上下槽缓冲液含Tris甘氨酸(pH8.3),分离胶中含 Tris-HCl(pH88)。系统中所有组分都含有0.1%的SDs( Laemmli,1970)。样品和浓缩胶中的 氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界,在移动界面的两边界之间是 电导较低而电位滴度较陡的区域,它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处 pH值较高,有利于甘氨酸的离子化,所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子 之后,沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后,SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区 带泳动穿过分离胶,并被筛分而依各自的大小得到分离。 SDS与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。SDS-蛋白质复合物的流体力学和光学性 质表明,它们在水溶液中的形状,近似于雪茄烟形状的长椭园棒,不同蛋白质的SDS复合 物的短轴长度都一样(约为18A,即1.8mm),而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这 样的SDS-蛋白质复合物,在凝胶电泳中的迁移率,不再受蛋白质原有电荷和形状的影响, 而只是椭园棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。 由于SDS和巯基乙醇的作用,蛋白质完全变性和解聚,解离成亚基或单个肽链,因此 测定的结果只是亚基或单条肽链的分子量 SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离筢围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。 在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液,而经双丙烯酰胺交联后凝 胶的刚性和抗张强度都有所增加,并形成SDS蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的 孔径随“双丙烯酰胺~丙烯酰胺”比率的增加而变小,比率接近1:20时孔径达到最小值。 SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺~丙烯酰胺”为1:29配制,试验表明它能分离 大小相差只有3%的蛋白质。 凝胶的筛分特性取决于它的孔径,而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓 度的函数。用5~15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表:
188 实验四 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由 Ornstein(1964) 和 Davis(1964) 设计的, 样品和 浓缩胶 中含 Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽缓冲 液含 Tris- 甘氨酸(pH 8.3), 分离胶中含 Tris-HCl(pH 8.8)。系统中所有组分都含有 0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970)。样品和浓缩胶中的 氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是 一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处 pH 值较高， 有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子 之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和 pH 值均匀的区 带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。 SDS 与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。SDS-蛋白质复合物的流体力学和光学性 质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的 SDS 复合 物的短轴长度都一样（约为 18Å，即 1.8nm），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这 样的 SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响， 而只是椭园棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。 由于 SDS 和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或单个肽链，因此 测定的结果只是亚基或单条肽链的分子量。 SDS 聚丙烯酰胺凝胶的有效分离笵围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。 在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝 胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成 SDS 蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的 孔径随 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。 SDS 聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为 1：29 配制，试验表明它能分离 大小相差只有 3% 的蛋白质。 凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓 度的函数。用 5～15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表：
SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 *丙烯酰胺浓度(%) 线性分离范围(kD) 12~43 16~68 36~9 *双丙烯酰胺~丙烯酰胺摩尔比为1:29。 1.SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制 (1)试剂 ①丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺。以温热(利于溶解双丙烯酰胺)的去离子水 配制含有29%(w/)丙烯酰胺和1%(w/v)N,N∴-亚甲双丙烯酰胺的贮存液,丙烯酰胺和 双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸,这一脱氨基反应是光催化或碱催化 的,故应核实溶液的pH值不超过7.0。这一溶液置棕色瓶中贮存于室温,每隔几个月须重 新配制 小心:丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。 ②十二烷基硫酸钠(SDS)。SDS可用去离子水配成10%(w/)贮存液保存于室 ③用于制备分离胶和积层胶的Tris缓冲液。 ④ TEMED(NNN,N-四甲基乙二胺)。 TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加 速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合 ⑤过硫酸铵。过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。须 新鲜配制 ⑥Tris甘氨酸电泳缓冲液 (2)装置:使用不连续缓冲系统要求在垂直板凝胶上进行SDS聚丙烯酰胺电泳 2.SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制 (1)根据厂家说明书安装玻璃板。 (2)确定所需凝胶溶液体积,按下表给出的数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配 制一定体积的分离胶溶液。一旦加入 TEMED,马上开始聚合,故应立即快速旋动混合物并 进入下步操作
189 SDS 聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 *丙烯酰胺浓度（%） 线性分离范围（kD） 15 12～43 10 16～68 7.5 36～94 5.0 57～212 *双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为 1：29。 1. SDS 聚丙烯酰胺凝胶的配制 ⑴ 试剂 ①丙烯酰胺和 N, N’-亚甲双丙烯酰胺。以温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去离子水 配制含有 29%（w/v）丙烯酰胺和 1%（w/v）N, N’-亚甲双丙烯酰胺的贮存液，丙烯酰胺和 双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反应是光催化或碱催化 的，故应核实溶液的 pH 值不超过 7.0。这一溶液置棕色瓶中贮存于室温，每隔几个月须重 新配制。 小心：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。 ② 十二烷基硫酸钠（SDS）。SDS 可用去离子水配成 10%（w/v）贮存液保存于室 温。 ③用于制备分离胶和积层胶的 Tris 缓冲液。 ④TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)。TEMED 通过催化过硫酸铵形成自由基而加 速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 ⑤过硫酸铵。 过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。须 新鲜配制。 ⑥Tris-甘氨酸电泳缓冲液。 ⑵ 装置： 使用不连续缓冲系统要求在垂直板凝胶上进行 SDS 聚丙烯酰胺电泳。 2．SDS 聚丙烯酰胺凝胶的灌制 ⑴ 根据厂家说明书安装玻璃板。 ⑵ 确定所需凝胶溶液体积，按下表给出的数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配 制一定体积的分离胶溶液。一旦加入 TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并 进入下步操作
配制Tris-甘氨酸SDs聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液 溶液成分 总体积总体积总体积总体积总体积总体积 20ml 10.6ml 15.9ml 3%丙烯酰胺10mn1|20mn130m40m 6.0ml 1.5M Tris(pH 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0n 6.3ml 7.5ml 10% SDS 0.05ml 0.1ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml 10%过硫酸胺005 0.1ml015ml 0.25ml 0.3ml TEMED 0.004 0008ml0012ml0016ml 0.02ml 0.024ml 8% 2.3ml 4.6ml 6.9ml 11. 5ml 13.9ml 30%丙烯酰胺1.3ml 1.5M Tris(pH 1.3ml2.5ml38ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml 10% SDS 0.1ml 0.25ml 0.3ml 10%过硫酸胺|005ml|0.ml TEMED 0.003ml0.006ml0.009ml 0.012ml 0.015ml 0. 018ml 11.9ml 30%丙烯酰胺1.7ml 3.3ml 8.3ml 100ml 1.5M Tris(pH 1.3ml 2.5ml38ml 5.0ml 6.3ml 7. 5ml 10% SDS 0.05ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml 10%过硫酸胺005ml0ml0.15ml 0.25ml TEMED 0.002 0.004ml0.006ml0.008m 0. 01ml 0.012ml
190 配制 Tris-甘氨酸 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液 溶液成分 总体积 5ml 总体积 10ml 总体积 15ml 总体积 20ml 总体积 25ml 总体积 30ml 6% 水 2.6ml 5.3ml 7.9ml 10.6ml 13.2ml 15.9ml 30%丙烯酰胺 1.0ml 2.0ml 3.0ml 4.0ml 5.0ml 6.0ml 1.5M Tris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml 10% SDS 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml 10%过硫酸胺 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml TEMED 0.004ml 0.008ml 0.012ml 0.016ml 0.02ml 0.024ml 8% 水 2.3ml 4.6ml 6.9ml 9.3ml 11.5ml 13.9ml 30%丙烯酰胺 1.3ml 2.7ml 4.0ml 5.3ml 6.7ml 8.0ml 1.5M Tris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml 10% SDS 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml 10%过硫酸胺 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml TEMED 0.003ml 0.006ml 0.009ml 0.012ml 0.015ml 0.018ml 10% 水 1.9ml 4.0ml 5.9ml 7.9ml 9.9ml 11.9ml 30%丙烯酰胺 1.7ml 3.3ml 5.0ml 6.7ml 8.3ml 10.0ml 1.5M Tris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml 10% SDS 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml 10%过硫酸胺 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml TEMED 0.002ml 0.004ml 0.006ml 0.008ml 0.01ml 0.012ml
1.6ml 3.3ml 4.9ml66ml 8.2ml 9.9ml 30%丙烯酰胺|20ml 4.0ml 12.0ml 1.5M Tris(pH 1.3ml 2.5ml38ml 6.3ml 10% SDS 0.05ml 10%过硫酸胺|005m01ml015ml 0.25ml 0.3ml TEMED 0.002ml|0.004ml|0.006ml0.008ml 0. 01ml 0.012ml 15% 1. Iml 2.3ml 3.4ml 4.6m 5.7ml 6.9ml 30%丙烯酰胺|2.5ml 5.0ml 7.5ml 100m 12.5ml 150ml 1.5M Tris(pH 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3 7.5ml 10%SD 0 0.15ml 0.2m 0.3 0%过硫酸胺005ml01ml|0.15ml 0.25ml TEMED 0002m|0004m10006m0008m00lml 0.012m (3)迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液,留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的 长再加0.5m)。再在胶液面上小心注入一层水(约2-3mm高),以阻止氧气进入凝胶溶液 (4)分离胶聚合完全后(约30分钟),倾出覆盖水层,再用滤纸吸净残留水。 (5)制备浓缩胶:按下表给出的数据,在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓度的丙 烯酰胺溶液,一旦加入 TEMED,马上开始聚合,故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。 配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5%浓缩胶溶液 溶液成分 总体积3ml总体积4m总体积5ml总体积6ml总体积8ml 30%丙烯酰胺0.5ml 0.67ml 1|68m1om1m IM Tris(pH0.38ml 0.5ml 0.63ml 0.75ml
191 12% 水 1.6ml 3.3ml 4.9ml 6.6ml 8.2ml 9.9ml 30%丙烯酰胺 2.0ml 4.0ml 6.0ml 8.0ml 10.0ml 12.0ml 1.5M Tris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml 10% SDS 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml 10%过硫酸胺 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml TEMED 0.002ml 0.004ml 0.006ml 0.008ml 0.01ml 0.012ml 15% 水 1.1ml 2.3ml 3.4ml 4.6ml 5.7ml 6.9ml 30%丙烯酰胺 2.5ml 5.0ml 7.5ml 10.0ml 12.5ml 15.0ml 1.5M Tris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml 10% SDS 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml 10%过硫酸胺 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml TEMED 0.002ml 0.004ml 0.006ml 0.008ml 0.01ml 0.012ml ⑶ 迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液,留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿 长再加 0.5cm)。再在胶液面上小心注入一层水（约 2~3mm 高），以阻止氧气进入凝胶溶液。 ⑷ 分离胶聚合完全后（约 30 分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。 ⑸ 制备浓缩胶：按下表给出的数据，在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓度的丙 烯酰胺溶液，一旦加入 TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。 配制 Tris-甘氨酸 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 5% 浓缩胶溶液 溶液成分 总体积 3ml 总体积 4ml 总体积 5ml 总体积 6ml 总体积 8ml 水 2.1ml 2.7ml 3.4ml 4.1ml 5.5ml 30%丙烯酰胺 0.5ml 0.67ml 0.83ml 1.0ml 1.3ml 1M Tris(pH 6.8) 0.38ml 0.5ml 0.63ml 0.75ml 1.0ml
0.03ml 0.04ml 0.06ml 10%过硫酸胺|003m 0.04ml 0.05ml TEMED 0.003n 0.004m 0.005ml 0.006ml (6)聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免 混入气泡,再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙,将凝胶垂直放置于室温下。 (7)在等待浓缩胶聚合时,可对样品进行处理,在样品中按1:1体积比加入样品处理液, 在100℃加热3分钟以使蛋白质变性。 样品处理液配方: 50mM Tris-HCI(pH l00 mM DTT(or5%巯基乙醇) 0.1%溴酚蓝 10%甘油 (8)浓缩胶聚合完全后(30分钟),小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上,上下 槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡 ris甘氨酸电极缓冲液 25mM Tris 250mM甘氨酸(pH8.3) 0.1%SDS (9)按予定顺序加样,加样量通常为10~25μ1(1.5mm厚的胶)。 00将电泳装置与电源相接,凝胶上所加电压为8v/cm。当染料前沿进入分离胶后, 把电压提高到15v/cm,继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约lcm,然后关闭电源。 αD从电泳装置上卸下玻璃板,用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔(第一槽)凝胶 下部切去一角以标注凝胶的方位 3.用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色 经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马斯亮蓝R250染色
192 10% SDS 0.03ml 0.04ml 0.05ml 0.06ml 0.08ml 10%过硫酸胺 0.03ml 0.04ml 0.05ml 0.06ml 0.08ml TEMED 0.003ml 0.004ml 0.005ml 0.006ml 0.008ml ⑹聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免 混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。 ⑺在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按 1:1 体积比加入样品处理液， 在 100℃加热 3 分钟以使蛋白质变性。 样品处理液配方： 50mM Tris-HCl(pH 6.8) 100mM DTT(or 5% 巯基乙醇) 2% SDS 0.1% 溴酚蓝 10%甘油 ⑻ 浓缩胶聚合完全后（30 分钟），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下 槽各加入 Tris-甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。 Tris-甘氨酸电极缓冲液： 25mM Tris 250mM 甘氨酸 (pH 8.3) 0.1% SDS ⑼ 按予定顺序加样，加样量通常为 10～25μl（1.5mm 厚的胶）。 ⑽ 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为 8V/cm。当染料前沿进入分离胶后， 把电压提高到 15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约 1cm，然后关闭电源。 ⑾ 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶 下部切去一角以标注凝胶的方位。 3．用考马斯亮蓝对 SDS 聚丙烯酰胺凝胶进行染色 经 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马斯亮蓝 R250 染色