实验十猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定 、实验目的 学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的基本方法 2.学习用紫外法测定酶活性,搞清酶活性与比活性的概念。 、实验原理 胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中,在Ca2+的存在下,被肠激酶或 有活性的胰蛋白酶自身激活,从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开,失 去一段六肽,分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶 胰蛋白酶原的分子量约为24000其等电点约为pH89,胰蛋白酶的分子量与其酶 原接近(23300),其等电点约为pH0.8,最适pH76~8.0,在pH=3时最稳定,低于此 pH时,胰蛋白酶易变性,在pH>5时易自溶。Ca2离子对胰蛋白酶有稳定作用 重金属离子,有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性,胰脏、卵清和豆类 植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。最近发现在一些植物的块基(如土豆、白薯、芋 头等)中也存在有胰蛋白酶抑制剂。 胰蛋白酶能催化蛋白质的水解,对于由碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸)的羧基与其 他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成 的酰胺键或酯键,其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶对这些键 的敏感性次序为:酯键>酰胺键>肽键。因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物 作为底物来测定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺(简称BAPA) 和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺(简称BANA)测定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙 酯(简称BAEE)和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯(简称TAME)测定酯酶活力。本实验以 BAEE为底物,用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。酶活力单位的规定常因底物及测定方 法而异 从动物胰脏中提取胰蛋白酶时,一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出 来,然后再根据等电点沉淀的原理,调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白 杂质,再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等(包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质, 再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等(包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原)沉淀析岀。 经溶解后,以极少量活性胰蛋白酶激活,使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶(糜蛋白酶 和弹性蛋白酶同时也被激活),被激活的酶溶液再以盐析分级的方法除去糜蛋白酶及弹 性蛋白酶等组分。收集含胰蛋白酶的级分,并用结晶法进一步分离纯化。一般经过2~3 次结晶后,可获得相当纯的胰蛋白酶,其比活力可达到 8000~10000BAEE单位毫克蛋白,或更高 如需制备更纯的制剂,可用上述酶溶液通过亲和层析方法纯化 、番材与试剂 (一)器材 1.新鲜或冰冻猪胰脏 2.食品加工机和高速分散器
244 实验十 猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定 一、实验目的 1. 学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的基本方法。 2. 学习用紫外法测定酶活性，搞清酶活性与比活性的概念。 二、实验原理 胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在 Ca2+的存在下，被肠激酶或 有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链 N 端 赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失 去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。 胰蛋白酶原的分子量约为 24000，其等电点约为 pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶 原接近（23300），其等电点约为 pH10.8，最适 pH7.6～8.0，在 pH=3 时最稳定，低于此 pH 时，胰蛋白酶易变性，在 pH>5 时易自溶。Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。 重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类 植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋 头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。 胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其 他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成 的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶对这些键 的敏感性次序为：酯键 > 酰胺键 > 肽键。因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物 作为底物来测定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称 BAPA） 和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称 BANA）测定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙 酯（简称 BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称 TAME）测定酯酶活力。本实验以 BAEE 为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。酶活力单位的规定常因底物及测定方 法而异。 从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出 来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节 pH 以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白 杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质， 再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。 经溶解后，以极少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶（糜蛋白酶 和弹性蛋白酶同时也被激活），被激活的酶溶液再以盐析分级的方法除去糜蛋白酶及弹 性蛋白酶等组分。收集含胰蛋白酶的级分，并用结晶法进一步分离纯化。一般经过 2～3 次结晶后，可获得相当纯的胰蛋白酶，其比活力可达到 8000～10000BAEE 单位/毫克蛋白，或更高。 如需制备更纯的制剂，可用上述酶溶液通过亲和层析方法纯化。 三、器材与试剂 （一）器材 1. 新鲜或冰冻猪胰脏 2. 食品加工机和高速分散器
3.研钵 4.大玻璃漏斗 5.小塑料桶 6.布氏漏斗 7.抽滤瓶 8.纱布 9.恒温水浴 10.紫外分光光度计 11.秒表 12.pH试纸 (二)试剂 1.pH4~4.5乙酸酸化水 2.2.5MH2SO 3. 5M NaOH 4.硫酸铵 5.氯化钙 6. 2M NaOH 7.0.8M,pH0硼酸缓冲液:取20ml0.8M硼酸溶液,加8ml0.2M四硼酸钠溶液, 混合后,用pH计检查校正 8.0.4MpH9.0硼酸缓冲液(用“7”稀释1倍即可) 9.0.2MpH8.0硼酸缓冲液:取πoml0.2M硼酸溶液,加30ml0.5M四硼酸钠溶液 混合后,用pH计校正。 10. 2M HCI 11. 00IMHCI 12.BAEE-0.15MpH!:0Tris-HCl缓冲液(每毫升Tis缓冲液含0.11毫克BAEE 和222毫克的氯化钙) 四、实验步骤 1.猪胰蛋白酶结晶步骤 猪胰脏10公斤(新鲜的或杀后立即冷藏的),除去脂肪和结缔组织后,绞碎,加入 2倍体积予冷的乙酸酸化水(pH40~45)于10~15℃搅拌提取24小时,四层纱布过滤 得乳白色滤液,用2.5MHSO4调p至2.5~30,放置3~4小时后用折迭滤纸过滤得 黄色透明滤液(约1.5升),加入固体硫酸铵(予先硏细),使溶液达0.75饱和度(每升 滤液加492克)放置过夜后抽滤(挤压干),滤饼分次加入10倍体积(按饼重计)冷的 蒸馏水,使滤饼溶解,得胰蛋白酶原溶液,取样0.5m后进行活化:慢慢加入研细的固 体无水氯化钙(滤饼中硫酸铵的含量按饼重的四分之一计)使Ca+与SO42结合后,溶 液中仍含有0 IM Cacl2,边加边搅拌,用5 MNaOH调pH至80,加入极少量猪胰蛋白 酶轻轻搅拌,于室温下活化8~10小时,(2~3小时取样一次,并用0.001MHCl稀释 测定酶活性增加的情况。活化完成(比活约3500~4000BAEE单位)后,用25MH2SO4 调pH至2.5~3.0,抽滤除去CaSO4沉淀,弃去滤饼,滤液取样测定胰蛋白酶活性及蛋 245
245 3. 研钵 4. 大玻璃漏斗 5. 小塑料桶 6. 布氏漏斗 7. 抽滤瓶 8. 纱布 9. 恒温水浴 10. 紫外分光光度计 11. 秒表 12. pH 试纸 （二）试剂 1. pH4～4.5 乙酸酸化水 2. 2.5M H2SO4 3. 5M NaOH 4. 硫酸铵 5. 氯化钙 6. 2M NaOH 7. 0.8M，pH9.0 硼酸缓冲液：取 20ml 0.8M 硼酸溶液，加 80ml 0.2M 四硼酸钠溶液， 混合后，用 pH 计检查校正。 8. 0.4M pH9.0 硼酸缓冲液（用“7”稀释 1 倍即可） 9. 0.2M pH8.0 硼酸缓冲液：取 70ml 0.2M 硼酸溶液，加 30ml 0.5M 四硼酸钠溶液， 混合后，用 pH 计校正。 10. 2M HCl 11. 0.01M HCl 12. BAEE－0.15M pH8.0Tris－HCl 缓冲液（每毫升 Tris 缓冲液含 0.11 毫克 BAEE 和 2.22 毫克的氯化钙） 四、实验步骤 1. 猪胰蛋白酶结晶步骤 猪胰脏 1.0 公斤（新鲜的或杀后立即冷藏的），除去脂肪和结缔组织后，绞碎，加入 2 倍体积予冷的乙酸酸化水（pH4.0～4.5）于 10～15℃搅拌提取 24 小时，四层纱布过滤 得乳白色滤液，用 2.5M H2SO4 调 pH 至 2.5～3.0，放置 3～4 小时后用折迭滤纸过滤得 黄色透明滤液（约 1.5 升），加入固体硫酸铵（予先研细），使溶液达 0.75 饱和度（每升 滤液加 492 克）放置过夜后抽滤（挤压干），滤饼分次加入 10 倍体积（按饼重计）冷的 蒸馏水，使滤饼溶解，得胰蛋白酶原溶液，取样 0.5ml 后进行活化：慢慢加入研细的固 体无水氯化钙（滤饼中硫酸铵的含量按饼重的四分之一计）使 Ca2+与 SO4 2-结合后，溶 液中仍含有 0.1M CaCl2，边加边搅拌，用 5M NaOH 调 pH 至 8.0，加入极少量猪胰蛋白 酶轻轻搅拌，于室温下 活化 8～10 小时，（2～3 小时取样一次，并用 0.001M HCl 稀释）， 测定酶活性增加的情况。活化完成（比活约 3500～4000BAEE 单位）后，用 2.5M H2SO4 调 pH 至 2.5～3.0，抽滤除去 CaSO4 沉淀，弃去滤饼，滤液取样测定胰蛋白酶活性及蛋
白质含量,按242克/升加入细粉状固体硫酸铵,使溶液达到0.4饱和度,放置数小时 后,抽滤,弃去滤饼,滤液按250克/升加入研细的硫酸铵,使溶液饱度达到0.75, 放置数小时,抽滤,弃去滤液,滤饼(粗胰蛋白酶)溶解后进行结晶:按每克滤饼溶于 l. Oml ph9.0的04M硼酸缓冲液的量计加入缓冲液,小心搅拌溶解,取样后,用2M NaOH调pH至8.0,注意要小心调节,偏酸不易结晶,偏碱易失活,存放于冰箱。 放置数小时后,应出现大量絮状物,溶液逐渐变稠呈胶态,再加入总体积的1/4 1/5的pH80的0.2M硼酸缓冲液,使胶态分散,必要时加入少许胰蛋白酶晶体。 放置2~5天可得到大量胰蛋白酶结晶,每天观察,核对pH是否为80并及时调整 用显微镜观察,待结晶析出完全时,抽滤,母液回收,一次结晶的胰蛋白酶产物再进行 重结晶:用约1倍的0.025MHC,使上述结晶分散,加入约10~1.5倍体积的pH90的 0.8M硼酸缓冲液,至结晶酶全部溶解,取样后,用2 MNaOh调溶液pH至80(淮确) (体积过大,很难结晶),冰箱放置1~2天,可将大量结晶抽滤得第二次结晶产物(母 液回收),冰冻干燥后得重结晶的猪胰蛋白酶。 2.胰蛋白酶活性的测定 (1)紫外法测定酶溶液的蛋白质含量 在280mm测得蛋白质溶液的吸光度,除以该蛋白质的比消光系数,即可算出该蛋白 质溶液的浓度(mg/ml) 少量氯化钠、硫酸铵、磷酸盐、硼酸盐和τris等无明显干扰作用。紫外法操作简便、 快速,适合于制备过程中进行监测 测定时将待测酶液用0.0MHCl稀至适当浓度,以0.001MHCl1作对照 猪胰蛋白酶在280m的比消光系数为:E%1cm=13.5,所以当其浓度为1mgml时 消光系数应为1.35。 胰蛋白酶的蛋白含量(mgm)=A280×稀释倍数13 ()胰蛋白酶活力的测定(BAEE法):参见亲和层析实验 五、注意事项 1.胰脏必需是刚屠宰的新鲜组织或立即低温存放的,否则可能因组织自溶而导致 实验失败 2.在室温14~20℃条件下8~12小时可激活完全,激活时间过长,因酶本身自溶 而会使比活降低,比活性达到“3000~4000BAEE单位/mg蛋白”时即可停止激活 3.要想获得胰蛋白酶结晶,在进行结晶时应十分细心地按规定条件操作,切勿粗 心大意,前几步的分离纯化效果愈好,则培养结晶也较容易,因此每一步操作都要严格 酶蛋白溶液过稀难形成结晶,过浓则易形成无定形沉淀析出,因此,必需恰到好处, 般来说待结晶的溶液开始时应略呈微浑浊状态。 4.过酸或过碱都会影响结晶的形成及酶活力变化,必须严格控制PH 5.第一次结晶时,3~5天后仍然无结晶,应检査pH,必要时调整pH或接种,促 使结晶形成。重结晶时间要短些
246 白质含量，按 242 克/升 加入细粉状固体硫酸铵，使溶液达到 0.4 饱和度，放置数小时 后，抽滤，弃去滤饼，滤液按 250 克/升 加入研细的硫酸铵，使溶液饱度达到 0.75， 放置数小时，抽滤，弃去滤液，滤饼（粗胰蛋白酶）溶解后进行结晶：按每克滤饼溶于 1.0ml pH9.0 的 0.4M 硼酸缓冲液的量计加入缓冲液，小心搅拌溶解，取样后，用 2M NaOH 调 pH 至 8.0，注意要小心调节，偏酸不易结晶，偏碱易失活，存放于冰箱。 放置数小时后，应出现大量絮状物，溶液逐渐变稠呈胶态，再加入总体积的 1/4～ 1/5 的 pH8.0 的 0.2M 硼酸缓冲液，使胶态分散，必要时加入少许胰蛋白酶晶体。 放置 2～5 天可得到大量胰蛋白酶结晶，每天观察，核对 pH 是否为 8.0 并及时调整。 用显微镜观察，待结晶析出完全时，抽滤，母液回收，一次结晶的胰蛋白酶产物再进行 重结晶：用约 1 倍的 0.025M HCl，使上述结晶分散，加入约 1.0～1.5 倍体积的 pH9.0 的 0.8M 硼酸缓冲液，至结晶酶全部溶解，取样后，用 2M NaOH 调溶液 pH 至 8.0（准确） （体积过大，很难结晶），冰箱放置 1～2 天，可将大量结晶抽滤得第二次结晶产物(母 液回收)，冰冻干燥后得重结晶的猪胰蛋白酶。 2. 胰蛋白酶活性的测定 ⑴ 紫外法测定酶溶液的蛋白质含量 在 280nm 测得蛋白质溶液的吸光度，除以该蛋白质的比消光系数，即可算出该蛋白 质溶液的浓度（mg/ml）。 少量氯化钠、硫酸铵、磷酸盐、硼酸盐和 Tris 等无明显干扰作用。紫外法操作简便、 快速，适合于制备过程中进行监测。 测定时将待测酶液用 0.001M HCl 稀至适当浓度，以 0.001M HCl 作对照。 猪胰蛋白酶在 280nm 的比消光系数为：E 1% 1cm=13.5 ，所以当其浓度为 1mg/ml 时， 消光系数应为 1.35。 胰蛋白酶的蛋白含量(mg/ml)＝ A280×稀释倍数/1.35 ⑵ 胰蛋白酶活力的测定（BAEE 法）：参见亲和层析实验。 五、注意事项 1. 胰脏必需是刚屠宰的新鲜组织或立即低温存放的，否则可能因组织自溶而导致 实验失败。 2. 在室温 14～20℃条件下 8～12 小时可激活完全，激活时间过长，因酶本身自溶 而会使比活降低， 比活性达到“3000～4000BAEE 单位/mg 蛋白” 时即可停止激活。 3. 要想获得胰蛋白酶结晶，在进行结晶时应十分细心地按规定条件操作，切勿粗 心大意，前几步的分离纯化效果愈好，则培养结晶也较容易，因此每一步操作都要严格。 酶蛋白溶液过稀难形成结晶，过浓则易形成无定形沉淀析出，因此，必需恰到好处，一 般来说待结晶的溶液开始时应略呈微浑浊状态。 4. 过酸或过碱都会影响结晶的形成及酶活力变化，必须严格控制 PH。 5. 第一次结晶时，3～5 天后仍然无结晶，应检查 pH，必要时调整 pH 或接种，促 使结晶形成。重结晶时间要短些