实验九酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究 本实验为学生提供一个较全面的实践机会,学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶, 并对这种酶的性质,尤其是动力学性质作初步的研究 自1860年 Bertholet从酒酵母 Saccharomyces Cerevisiae中发现了蔗糖酶以来,它已 被广泛地进行了研究。蔗糖酶( Invertase)(β一D—呋喃果糖苷果糖水解酶) ( fructofuranoside fructohydrolase)(EC.3.2.1.26)特异地催化非还原糖中的α一呋喃果糖 苷键水解,具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖,也能催化棉子糖 水解,生成密二糖和果糖 本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内 侧,在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶( external yeast invertase),其活力占蔗糖酶 活力的大部分,是含有50%糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖
222 实验九 酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究 本实验为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶， 并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。 自 1860 年 Bertholet 从酒酵母 Sacchacomyces Cerevisiae 中发现了蔗糖酶以来，它已 被广泛地进行 了研究。蔗 糖酶（invertase）（ —D—呋 喃果糖苷果 糖水解酶） （fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的—呋喃果糖 苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖 水解，生成密二糖和果糖。 本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内 侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（external yeast invertase）, 其活力占蔗糖酶 活力的大部分，是含有 50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖
酶( internal yeast invertase),含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基,二聚体, 两种形式的酶的氨基酸组成不同,外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸,Ser和Met,它 们的分子量也不同,外酶约为27万域或22万,与酵母的来源有关),内酶约为135万。 尽管这两种酶在组成上有较大的差别,但其底物专一性和动力学性质仍十分相似,因此, 本实验未区分内酶与外酶,而且由于内酶含量很少,极难提取,本实验提取纯化的主要 是外酶 两种酶的性质对照表如下 名称 糖含 量 亚为蔗为棉等电最适稳定最适 糖的子糖点 温度 的K 范围 外27万50%双|26mM150 50|4.93.53.0 60℃ 酶(22万) mM ~5.5)75 内13.5|<3%双25mM|150 酶万 mM ~5.5)90 实验中,用测定生成还原糖(葡萄糖和果糖)的量来测定蔗糖水解的速度,在给定 的实验条件下,每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的 活力单位数。 本实验共有九个分实验: 蔗糖酶的提取与部分纯化 、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定 四、反应时间对产物形成的影响 五、pH对酶活性的影响和最适pH的测定 六、温度对酶活性的影响和反应活化能的测定 七、底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数K和最大反应速度V的测定 八、尿素(脲)抑制蔗糖酶的实验 九、棉子糖和果糖抑制蔗糖酶的实验 (一)蔗糖酶的提取与部分纯化 实验目的: 学习酶的纯化方法,并为动力学实验提供一定量的蔗糖酶。 二、试剂 1.啤酒酵母 2.二氧化硅
223 酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体， 两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser 和 Met，它 们的分子量也不同，外酶约为 27 万(或 22 万，与酵母的来源有关)，内酶约为 13.5 万。 尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此， 本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要 是外酶。 两种酶的性质对照表如下： 名 称 MW 糖 含 量 亚基 底 物 为 蔗 糖 的 Km 底 物 为 棉 子 糖 的 Km 等 电 点 pI 最适 pH 稳定 pH 范围 最适 温度 外 酶 27 万 (22 万) 50% 双 26mM 150 mM 5.0 4.9(3.5 ～5.5) 3.0 ～ 7.5 60℃ 内 酶 13.5 万 ＜3% 双 25mM 150 mM 4.5(3.5 ～5.5) 6.0 ～ 9.0 实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度，在给定 的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的 活力单位数。 本实验共有九个分实验： 一、蔗糖酶的提取与部分纯化 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定 四、反应时间对产物形成的影响 五、pH 对酶活性的影响和最适 pH 的测定 六、温度对酶活性的影响和反应活化能的测定 七、底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数 Km和最大反应速度 Vmax 的测定 八、尿素（脲）抑制蔗糖酶的实验 九、棉子糖和果糖抑制蔗糖酶的实验 （一） 蔗糖酶的提取与部分纯化 一、实验目的： 学习酶的纯化方法，并为动力学实验提供一定量的蔗糖酶。 二、试剂： 1. 啤酒酵母 2. 二氧化硅
3.甲苯(使用前预冷到0℃以下) 4.去离子水(使用前冷至4℃左右) 5.冰块、食盐 6.1N乙酸 7.95%乙醇 、仪器: 研钵1个 2.离心管3个 3.滴管3个 4.量筒50ml1个 5.水浴锅1个 6.恒温水浴 7.烧杯100m12个 8.广泛pH试纸 9.高速冷冻离心机 四、操作步骤: 1.提取 (1)准备一个冰浴,将研钵稳妥放入冰浴中。 (2)称取5g干啤酒酵母和20g湿啤酒酵母,称20mg蜗牛酶及适量(约10g)二氧 化硅,放入研钵中。二氧化硅要予先研细 (3)量取预冷的甲苯3om缓慢加入酵母中,边加边研磨成糊状,约需60分钟。研 磨时用显微镜检査硏磨的效果,至酵母细胞大部分硏碎。 (4)缓慢加入预冷的40ml去离子水,每次加2m左右,边加边研磨,至少用30分 钟。以便将蔗糖酶充分转入水相。 (5)将混合物转入两个离心管中,平衡后,用高速冷离心机离心,4℃,10000pm, omin。如果中间白色的脂肪层厚,说明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相。 (6)用滴管小心地取出脂肪层下面的水相,转入另一个清洁的离心管中,4℃, 1000pm,离心10min (7)将清液转入量筒,量出体积,留出1.5ml测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转 入清洁离心管中 (8)用广泛pH试纸检查清液pH,用N乙酸将pH调至50,称为“粗级分I 2.热处理 (1)予先将恒温水浴调到50℃,将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中,50℃ 下保温30分钟,在保温过程中不断轻摇离心管。 (2)取出离心管,于冰浴中迅速冷却,用4℃,1000m,离心10min (3)将上清液转入量筒,量出体积,留出1.5ml测定酶活力及蛋白质含量(称为“热 级分II 3.乙醇沉淀 将热级分Ⅱ转入小烧杯中,放入冰盐浴(没有水的碎冰撒入少量食盐),逐滴加入
224 3. 甲苯（使用前预冷到 0℃以下） 4. 去离子水（使用前冷至 4℃左右） 5. 冰块、食盐 6. 1N 乙酸 7. 95%乙醇 三、仪器： 1. 研钵 1 个 2. 离心管 3 个 3. 滴管 3 个 4. 量筒 50ml 1 个 5. 水浴锅 1 个 6. 恒温水浴 7. 烧杯 100ml 2 个 8. 广泛 pH 试纸 9. 高速冷冻离心机 四、操作步骤： 1. 提取 （1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。 （2）称取 5g 干啤酒酵母和 20g 湿啤酒酵母，称 20mg 蜗牛酶及适量（约 10g）二氧 化硅，放入研钵中。二氧化硅要予先研细。 （3）量取预冷的甲苯 30ml 缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需 60 分钟。研 磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。 （4）缓慢加入预冷的 40ml 去离子水，每次加 2ml 左右，边加边研磨，至少用 30 分 钟。以便将蔗糖酶充分转入水相。 （5）将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷离心机离心，4℃，10000rpm， 10min。如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相。 （6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃， 10000rpm，离心 10min。 （7）将清液转入量筒，量出体积，留出 1.5ml 测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转 入清洁离心管中。 （8）用广泛 pH 试纸检查清液 pH，用 1N 乙酸将 pH 调至 5.0，称为“粗级分 I”。 2. 热处理 （1）予先将恒温水浴调到 50℃，将盛有粗级分 I 的离心管稳妥地放入水浴中，50℃ 下保温 30 分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。 （2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用 4℃，10000rpm，离心 10min。 （3）将上清液转入量筒，量出体积，留出 1.5ml 测定酶活力及蛋白质含量（称为“热 级分 II”）。 3. 乙醇沉淀 将热级分 II 转入小烧杯中，放入冰盐浴（没有水的碎冰撒入少量食盐），逐滴加入
等体积预冷至一20℃的95%乙醇,同时轻轻搅拌,共需30分钟,再在冰盐浴中放置10 分钟,以沉淀完全。于4℃,1000rpm,离心10min,倾去上清,并滴干,沉淀保存于 离心管中,盖上盖子或薄膜封口,然后将其放入冰箱中冷冻保存(称为“醇级分Ⅲ”) 废弃上清液之前,要用尿糖试纸检査其酶活性(于下一个实验一起做) (二)离子交换柱层析纯化蔗糖酶 、试剂 1.DEAE纤维素:DE-231.5克 2.0.5N NaOH 100ml 3.0.5N HCL 50ml 4.0.02mol/LpH7.3 Tris-HCI缓冲液250ml 5.0.02mo/LpH73(含0.2mol/L浓度NaCl)的 Tris-HCl缓冲液50ml 二、仪器 1.层析柱 2.部分收集器 3.磁力搅拌器及搅拌子 4.50m小烧杯2个 5.玻璃砂漏斗 6.真空泵与抽滤瓶 7.精密pH试纸或pH计 8.三通管 9.止水夹 10.吸耳球 11.塑料紫外比色杯 12.电导率仪 13.尿糖试纸 14.点滴板 三、操作步骤 1.离子交换剂的处理 称取15克DEAE纤维素(DE-23)干粉,加入0.5 mol/L Naoh溶液(约50ml), 轻轻搅拌,浸泡至少0.5小时(不超过1小时),用玻璃砂漏斗抽滤,并用去离子水洗至 近中性,抽干后,放入小烧杯中,加50m10.5 mol/L HCl,搅匀,浸泡05小时,同上 用去离子水洗至近中性,再用0.5 molL Naoh重复处理一次,用去离子水洗至近中性后, 抽干备用。(因DEAE纤维素昂贵,用后务必回收)。实际操作时,通常纤维素是已浸泡 过回收的,按“碱→酸”的顺序洗即可,因为酸洗后较容易用水洗至中性。碱洗时因过 滤困难,可以先浮选除去细颗粒,抽干后用05 mol/L NaOH-0.5 mol/L NaCl溶液处理 然后水洗至中性 2.装柱与平衡:
225 等体积预冷至－20℃的 95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需 30 分钟，再在冰盐浴中放置 10 分钟，以沉淀完全。于 4℃，10000rpm，离心 10min，倾去上清，并滴干，沉淀保存于 离心管中，盖上盖子或薄膜封口，然后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“醇级分Ⅲ”）。 废弃上清液之前，要用尿糖试纸检查其酶活性（于下一个实验一起做）。 （二）离子交换柱层析纯化蔗糖酶 一、试剂 1. DEAE 纤维素：DE-23 1.5 克 2. 0.5N NaOH 100ml 3. 0.5 N HCL 50ml 4. 0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液 250ml 5. 0.02 mol/L pH7.3（含 0.2 mol/L 浓度 NaCl）的 Tris-HCl 缓冲液 50ml 二、仪器 1. 层析柱 2. 部分收集器 3. 磁力搅拌器及搅拌子 4. 50ml 小烧杯 2 个 5. 玻璃砂漏斗 6. 真空泵与抽滤瓶 7. 精密 pH 试纸或 pH 计 8. 三通管 9. 止水夹 10. 吸耳球 11. 塑料紫外比色杯 12. 电导率仪 13. 尿糖试纸 14. 点滴板 三、操作步骤 1. 离子交换剂的处理： 称取 1.5 克 DEAE 纤维素（DE-23）干粉，加入 0.5mol/L NaOH 溶液（约 50ml）， 轻轻搅拌，浸泡至少 0.5 小时（不超过 1 小时），用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至 近中性，抽干后，放入小烧杯中，加 50ml 0.5 mol/L HCl, 搅匀，浸泡 0.5 小时，同上， 用去离子水洗至近中性，再用 0.5 mol/L NaOH 重复处理一次，用去离子水洗至近中性后， 抽干备用。（因 DEAE 纤维素昂贵，用后务必回收）。实际操作时，通常纤维素是已浸泡 过回收的，按“碱→酸”的顺序洗即可，因为酸洗后较容易用水洗至中性。碱洗时因过 滤困难，可以先浮选除去细颗粒，抽干后用 0.5 mol/L NaOH－0.5 mol/L NaCl 溶液处理， 然后水洗至中性。 2. 装柱与平衡：
先将层析柱垂直装好,在烧杯内用002 mol/L pH7.3 Tris-HCI缓冲液洗纤维素几 次,用滴管吸取烧杯底部大颗粒的纤维素装柱,然后用此缓冲液洗柱至流出液的电导率 与缓冲液相同或接近时即可上样 3.上样与洗脱: 上样前先准备好梯度洗脱液,本实验采用20ml0.02MpH7.3的 Tris-HCI缓冲液和 20ml含02M浓度NaCl的0.02 mol/L pH73的 Tris-HCI缓冲液,进行线性梯度洗脱。取 两个相同直径的50ml小烧杯,一个装20m含NaCl的高离子强度溶液,另一个装入20ml 低离子强度溶液,放在磁力搅拌器上,在低离子强度溶液的烧杯内放入一个小搅拌子(在 细塑料管内放入一小段铁丝,两端用酒精灯加热封口),将此烧杯置于搅拌器旋转磁铁 的上方。将玻璃三通插入两个烧杯中,上端接一段乳胶管,夹上止水夹,用吸耳球小心 地将溶液吸入三通(轻轻松一下止水夹),立即夹紧乳胶管,使两烧杯溶液形成连通, 注意两个烧杯要放妥善,切勿使一杯高、一杯低 用5ml0.02 mol/L pH7.3的 Tris-HCI缓冲液充分溶解醇级分Ⅲ,(注意玻璃搅棒头必 须烧园、搅拌溶解时不可将离心管划伤),若溶液混浊,则用小试管,4000pm离心除 去不溶物。取1.5m上清液(即醇级分Ⅲ样品,留待下一个实验测酶活力及蛋白含量), 将剩余的35m清液小心地加到层析柱上,不要扰动柱床,注意要从上样开始使用部分 收集器收集,每管2.5~30mJl0min。上样后用缓冲液洗两次,然后再用约20m缓冲液 洗去柱中未吸附的蛋白质,至A280降到0.1以下,夹住层析柱出口,将恒流泵入口的细 塑料导管放入不含NaCl的低离子强度溶液的小烧杯中,用胶布固定塑料管,接好层析 柱,打开磁力搅拌器,放开层析柱出口,开始梯度洗脱,连续收集洗脱液,两个小烧杯 中的洗脱液用尽后,为洗脱充分,也可将所配制的剩余30ml高离子强度洗脱液倒入小 烧杯继续洗脱,控制流速2.5~3,0 ml/10min。 测定每管洗脱液的A280光吸收值和电导率。(使用DJS-10电导电极) 测定不含NaCl的0.02 mol/L pH73 Tris-HCI缓冲液和含0.2moL浓度NaCl的 0.02mol/Lph73 Tris-HCI缓冲液的电导率,用电导率与NaCl浓度作图,利用此图将每 管所测电导率换算成NaCl浓度,并利用此曲线估计出蔗糖酶活性峰洗出时的NaCl浓度 4.各管洗脱液酶活力的定性测定 在点滴板上每一孔内,加一滴02 mol/L pH49的乙酸缓冲液,一滴0.5moL蔗糖和 滴洗脱液,反应5分钟,在每一孔内同时插入一小条尿糖试纸,10~20mi后观察试 纸颜色的变化。用“+”号的数目,表示颜色的深浅,即各管酶活力的大小。合并活性 最高的2~3管,量出总体积,并将其分成10份,分别倒入10个小试管,用保鲜膜封口, 冰冻保存,使用时取出一管。此即“柱级分IV”。 注意:从上样开始收集,可能有两个活性峰,梯度洗脱开始前的第一个峰是未吸附 物,本实验取用梯度洗脱开始后洗下来的活性峰 在同一张图上画出所有管的酶活力,NaCl浓度(可用电导率代替)和光吸收值A280 的曲线和洗脱梯度线
226 先将层析柱垂直装好，在烧杯内用 0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液洗纤维素几 次，用滴管吸取烧杯底部大颗粒的纤维素装柱，然后用此缓冲液洗柱至流出液的电导率 与缓冲液相同或接近时即可上样。 3. 上样与洗脱： 上样前先准备好梯度洗脱液，本实验采用 20ml 0.02M pH7.3 的 Tris-HCl 缓冲液和 20ml 含 0.2M 浓度 NaCl 的 0.02mol/L pH7.3 的 Tris-HCl 缓冲液，进行线性梯度洗脱。取 两个相同直径的 50ml 小烧杯，一个装 20ml 含 NaCl 的高离子强度溶液，另一个装入 20ml 低离子强度溶液，放在磁力搅拌器上，在低离子强度溶液的烧杯内放入一个小搅拌子（在 细塑料管内放入一小段铁丝，两端用酒精灯加热封口），将此烧杯置于搅拌器旋转磁铁 的上方。将玻璃三通插入两个烧杯中，上端接一段乳胶管，夹上止水夹，用吸耳球小心 地将溶液吸入三通（轻轻松一下止水夹），立即夹紧乳胶管，使两烧杯溶液形成连通， 注意两个烧杯要放妥善，切勿使一杯高、一杯低。 用 5ml 0.02mol/L pH7.3 的 Tris-HCl 缓冲液充分溶解醇级分Ⅲ，（注意玻璃搅棒头必 须烧园、搅拌溶解时不可将离心管划伤），若溶液混浊，则用小试管，4000rpm 离心除 去不溶物。取 1.5ml 上清液（即醇级分Ⅲ样品，留待下一个实验测酶活力及蛋白含量）， 将剩余的 3.5ml 清液小心地加到层析柱上，不要扰动柱床，注意要从上样开始使用部分 收集器收集，每管 2.5~3.0ml/10min。上样后用缓冲液洗两次，然后再用约 20ml 缓冲液 洗去柱中未吸附的蛋白质，至 A280 降到 0.1 以下，夹住层析柱出口，将恒流泵入口的细 塑料导管放入不含 NaCl 的低离子强度溶液的小烧杯中，用胶布固定塑料管，接好层析 柱，打开磁力搅拌器，放开层析柱出口，开始梯度洗脱，连续收集洗脱液，两个小烧杯 中的洗脱液用尽后，为洗脱充分，也可将所配制的剩余 30ml 高离子强度洗脱液倒入小 烧杯继续洗脱，控制流速 2.5~3.0ml/10min。 测定每管洗脱液的 A280 光吸收值和电导率。（使用 DJS-10 电导电极） 测定不含 NaCl 的 0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl 缓冲液和含 0.2mol/L 浓度 NaCl 的 0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl 缓冲液的电导率，用电导率与 NaCl 浓度作图，利用此图将每 管所测电导率换算成NaCl浓度，并利用此曲线估计出蔗糖酶活性峰洗出时的NaCl浓度。 4. 各管洗脱液酶活力的定性测定 在点滴板上每一孔内，加一滴 0.2mol/L pH4.9 的乙酸缓冲液，一滴 0.5mol/L 蔗糖和 一滴洗脱液，反应 5 分钟，在每一孔内同时插入一小条尿糖试纸，10～20min 后观察试 纸颜色的变化。用“+”号的数目，表示颜色的深浅，即各管酶活力的大小。合并活性 最高的 2~3 管，量出总体积，并将其分成 10 份，分别倒入 10 个小试管，用保鲜膜封口， 冰冻保存，使用时取出一管。此即“柱级分 IV”。 注意：从上样开始收集，可能有两个活性峰，梯度洗脱开始前的第一个峰是未吸附 物，本实验取用梯度洗脱开始后洗下来的活性峰。 在同一张图上画出所有管的酶活力，NaCl 浓度（可用电导率代替）和光吸收值 A280 的曲线和洗脱梯度线