华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程 004-7 细胞工程文本教案 教学目的与要求 细胞工程是现代生物技术的重要组成部分,同时也是现代生物学研究的重要技术工 具。要求学生通过本课程的学习掌握生物组织、器官及其细胞离体培养的原理与技术,为 从事生物学领域的相关研究及其与细胞工程有关的生物技术产业奠定良好的理论和技术 基础。 理论知识方面,重点掌握本学科的基本原理和基本技术即:细胞全能性学说在细胞 工程中的指导作用;培养条件下的细胞分化和器官发生的调控;离体培养条件下的遗传 与变异特点。掌握不同组织、器官的培养特点和控制方法。了解细胞工程的各类技术在现 代生物学与生物技术领域的应用途径与发展潜力。 实践技能方面,重点掌握细胞工程的基本操作技术一无菌操作;掌握外植体选择 愈伤组织和胚状体诱导、器官发生调控等基本技术;了解细胞大批量培养方法,原生质 体分离与体细胞杂交技术 课程学时及其分配 课程总学时60,其中课堂教授40学时,实验20学时 课堂讲授内容及学时分配表 章节 内容 学时 绪论 第一章实验室设置及技术原理 第二章细胞全能性与形态发生 第三章离体培养下的遗传与变异 第四章植物组织和器官培养 第五章植物细胞培养及次生代谢产物生产 第六章原生质体培养 第七章植物体细胞杂交 第八章人工种子 22645544224 第九章植物种质资源离体超低温保存 第十章动物细胞工程概述
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 细胞工程文本教案 教学目的与要求： 细胞工程是现代生物技术的重要组成部分，同时也是现代生物学研究的重要技术工 具。要求学生通过本课程的学习掌握生物组织、器官及其细胞离体培养的原理与技术，为 从事生物学领域的相关研究及其与细胞工程有关的生物技术产业奠定良好的理论和技术 基础。 理论知识方面，重点掌握本学科的基本原理和基本技术即：细胞全能性学说在细胞 工程中的指导作用；培养条件下的细胞分化和器官发生的调控；离体培养条件下的遗传 与变异特点。掌握不同组织、器官的培养特点和控制方法。了解细胞工程的各类技术在现 代生物学与生物技术领域的应用途径与发展潜力。 实践技能方面，重点掌握细胞工程的基本操作技术—无菌操作；掌握外植体选择、 愈伤组织和胚状体诱导、器官发生调控等基本技术；了解细胞大批量培养方法，原生质 体分离与体细胞杂交技术。 课程学时及其分配： 课程总学时 60，其中课堂教授 40 学时，实验 20 学时。 课堂讲授内容及学时分配表 章节 内 容 学时 绪论 2 第一章 实验室设置及技术原理 2 第二章 细胞全能性与形态发生 6 第三章 离体培养下的遗传与变异 4 第四章 植物组织和器官培养 5 第五章 植物细胞培养及次生代谢产物生产 5 第六章 原生质体培养 4 第七章 植物体细胞杂交 4 第八章 人工种子 2 第九章 植物种质资源离体超低温保存 2 第十章 动物细胞工程概述 4 1
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程 004-7 绪论(2学时) 教学目的与要求 全面了解细胞工程与现代生物技术的关系;了解细胞工程的发展与相关学科的联系 了解细胞工程在现代世界经济中的潜力。 第一节细胞工程在生物技术领域中的地位 生物技术概述 生物技术是以生物科学为基础,利用生物个体或生物器官、组织、细胞的特性和功 能,设计构建具有预期性状的新物种或新品系(包括细胞系),以及与工程原理相结 合进行产品加工生产的综合性技术体系。 生物技术的内涵主要是 运用现代生物学理论与科学技术改造细胞的遗传物质,培育出人们需要的生物新品 种; 工业规模地利用现有生物体系,制备生物产品 模拟生物体系,以生物化学工程代替化学工程,制备工业产品 发展相应的科学理论与工程技术。 主要技术范畴包括:基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程以及生化工程。 现代生物技术特征:多学科性;商业性;规模化。 细胞工程的概念及研究范畴 细胞工程( cell engineering)是应用细胞生物学和分子生物学方法,借助工程学的 试验方法或技术,在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性,以获得特定的细 胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科 广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术,狭义的细 胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术。 根据研究对象不同,细胞工程可分为动物细胞工程和植物细胞工程
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 绪 论（2 学时） 教学目的与要求 全面了解细胞工程与现代生物技术的关系；了解细胞工程的发展与相关学科的联系； 了解细胞工程在现代世界经济中的潜力。 第一节 细胞工程在生物技术领域中的地位 一、生物技术概述 生物技术是以生物科学为基础，利用生物个体或生物器官、组织、细胞的特性和功 能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系（包括细胞系），以及与工程原理相结 合进行产品加工生产的综合性技术体系。 生物技术的内涵主要是： 运用现代生物学理论与科学技术改造细胞的遗传物质，培育出人们需要的生物新品 种； 工业规模地利用现有生物体系，制备生物产品； 模拟生物体系，以生物化学工程代替化学工程，制备工业产品； 发展相应的科学理论与工程技术。 主要技术范畴包括：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程以及生化工程。 现代生物技术特征：多学科性；商业性；规模化。 二、细胞工程的概念及研究范畴 细胞工程（cell engineering）是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的 试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细 胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。 广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术，狭义的细 胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术。 根据研究对象不同，细胞工程可分为动物细胞工程和植物细胞工程。 2
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程 004-7 动物细胞工程包括:细胞培养技术(包括组织培养、器官培养);细胞融合技术; 胚胎工程技术(核移植、胚胎分割等);克隆技术(单细胞系克隆、器官克隆、个体克 隆 植物细胞工程包括:植物组织、器官培养技术;细胞培养技术;原生质体融合与培 养技术;亚细胞水平的操作技术等。 、细胞工程与其它相关学科的关系 细胞工程学科的建立依赖于相关学科理论的发展 2.为生物学研究提供新的实验体系 细胞工程必须与其它生物技术相结合才能更好地发挥作用 四、细胞工程在现代生物技术中的地位及其实践意义 1.改善农业生产技术 2.保护自然资源,维护生态平衡 生物医药开发 第二节动物物细胞工程的发展 融合现象的发现 19世纪30年代, Muller, Schwann, Virchow等相继在肺结核、天花、水痘、麻疹等病理 组织中观察到多核细胞现象,但当时并没有引起人们的关注,认为这只是一种特殊现象。 1849年 Lobing在骨髓中也发现了多核现象的存在,1855年~1858年,科学家们在 肺组织和各种正常组织及发尖和坏死部位都发现了多核细胞。至此,自然界中广泛存在 着多核细胞的事实,才被生命科学工作者接受。 1859年,A. Barli在研究黏虫的生活史时发现,某些黏虫存在着由单个细胞核融合 形成多核的原生质团的情况。据此,他认为多核细胞是由单个细胞彼此融合而形成的 二.动物组织细胞培养技术的建立 1907年,美国胚胎学家R. Harrison将蛙的胚神经管区的一片组织移植到蛙的淋巴液 凝块中,这片组织在体外不但存活了若干星期,而且还从细胞中长出了轴突(神经纤维) 细胞,解决了当时关于轴突起源的争论,并表明了利用体外存活的组织进行实验研究的 可能性。他所采用的把培养物放在盖玻片上并置于凹玻片腔中培养的方法还一直沿用至
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 动物细胞工程包括：细胞培养技术（包括组织培养、器官培养）；细胞融合技术； 胚胎工程技术 （核移植、胚胎分割等）；克隆技术（单细胞系克隆、器官克隆、个体克 隆）。 植物细胞工程包括：植物组织、器官培养技术；细胞培养技术；原生质体融合与培 养技术；亚细胞水平的操作技术等。 三、细胞工程与其它相关学科的关系 1．细胞工程学科的建立依赖于相关学科理论的发展 2．为生物学研究提供新的实验体系 3．细胞工程必须与其它生物技术相结合才能更好地发挥作用 四、细胞工程在现代生物技术中的地位及其实践意义 1．改善农业生产技术 2．保护自然资源，维护生态平衡 3．生物医药开发 第二节 动物物细胞工程的发展 一．融合现象的发现 19 世纪 30 年代，Muller, Schwann, Virchow 等相继在肺结核、天花、水痘、麻疹等病理 组织中观察到多核细胞现象，但当时并没有引起人们的关注，认为这只是一种特殊现象。 1849 年 Lobing 在骨髓中也发现了多核现象的存在，1855 年～1858 年，科学家们在 肺组织和各种正常组织及发尖和坏死部位都发现了多核细胞。至此，自然界中广泛存在 着多核细胞的事实，才被生命科学工作者接受。 1859 年，A. Barli 在研究黏虫的生活史时发现，某些黏虫存在着由单个细胞核融合 形成多核的原生质团的情况。据此，他认为多核细胞是由单个细胞彼此融合而形成的。 二. 动物组织细胞培养技术的建立 1907 年，美国胚胎学家 R. Harrison 将蛙的胚神经管区的一片组织移植到蛙的淋巴液 凝块中，这片组织在体外不但存活了若干星期，而且还从细胞中长出了轴突(神经纤维) 细胞，解决了当时关于轴突起源的争论，并表明了利用体外存活的组织进行实验研究的 可能性。他所采用的把培养物放在盖玻片上并置于凹玻片腔中培养的方法还一直沿用至 3
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程 004-7 Carrel(1911)发现了鸡胚浸出液对于某些细胞的生长具有很强的促进效应,还把无 菌技术引到了组织培养技术中。作为他的技术标志是,他在不含抗菌素的培养条件下使 鸡胚心脏细胞维持生存了34年,先后继代3400次,证明动物细胞有可能在体外无限地 生长。 1914年, Thomson创立了另一条完全不同的体外组织培养途径一器官培养法,以后 又被 Strangeways和Fe|所发展。 1940年, Earle建立了可以无限传代的一个CH小鼠的结缔组织细胞系一L系。二是 1951年,Gay建立了第一个人体细胞系一人体宫颈癌Hla细胞系 三.细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生 1958年, Okada发现紫外灭活的仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。由于仙台 病毒能稳定地诱发细胞融合而引起了许多科学家的兴趣,60年代, Harris(1965)诱导不 同的动物体细胞融合获得成功并能存活下来。 Lifflefield(1964)根据亲本细胞的酶缺陷型, 利用HAT选择性培养基能使亲本细胞死亡而只留下异型融合细胞,并能不断地增殖, 从此形成了细胞融合到杂种细胞选择、培养的一整套技术。使这一技术在此后广泛地应用 于遗传学、病毒学、免疫学、细胞学等多种学科的研究工作中 1975年,免疫学家 Kohler和 Milstein利用仙台病毒诱导绵羊红细胞免疫的小鼠脾细 胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,选择到能分泌单一抗体的杂种细胞。该杂种细胞具有在小鼠 体内和体外培养条件下大量繁殖的能力,并能长期地分泌单克隆抗体,从而建立了小鼠 淋巴细胞杂交瘤技术。这一技术的诞生把细胞融合技术从实验阶段推向了应用研究阶段 促进了动物细胞工程的蓬勃发展 四.动物克隆技术的建立 l891, Heape等人首次报道了家兔胚胎移植成功的结果,他们把安哥拉家兔胚胎移 植给比利时兔,得到了4只安哥拉家兔 本世纪30年代以后,先后在羊、猪、牛等动物的胚胎移植上获得成功。经过几十年的 不断完善和充实,已成为一项比较成熟的繁殖生物学技术。 首例克隆动物成功的报道是在1962年,英国学者 Grudon把非洲爪蟾小肠上皮细胞 的核注入同种或异种非洲爪蟾未受精卵(经紫外线照射杀死卵细胞核)中,约有1%的重 组卵发育成为成熟蛙 这一成功开创了由体细胞培育动物个体的新型实验途径,其贡献在于:实验证明了
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 今。 Carrel (1911)发现了鸡胚浸出液对于某些细胞的生长具有很强的促进效应，还把无 菌技术引到了组织培养技术中。作为他的技术标志是，他在不含抗菌素的培养条件下使 鸡胚心脏细胞维持生存了 34 年，先后继代 3400 次，证明动物细胞有可能在体外无限地 生长。 1914 年，Thomson 创立了另一条完全不同的体外组织培养途径－器官培养法，以后 又被 Strangeways 和 Fell 所发展。 1940 年，Earle 建立了可以无限传代的一个 C3H 小鼠的结缔组织细胞系－L 系。二是 1951 年，Gay 建立了第一个人体细胞系－人体宫颈癌 Hela 细胞系 三. 细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生 1958 年, Okada 发现紫外灭活的仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。由于仙台 病毒能稳定地诱发细胞融合而引起了许多科学家的兴趣，60 年代，Harris(1965)诱导不 同的动物体细胞融合获得成功并能存活下来。Lifflefield(1964)根据亲本细胞的酶缺陷型， 利用 HAT 选择性培养基能使亲本细胞死亡而只留下异型融合细胞，并能不断地增殖， 从此形成了细胞融合到杂种细胞选择、培养的一整套技术。使这一技术在此后广泛地应用 于遗传学、病毒学、免疫学、细胞学等多种学科的研究工作中。 1975 年，免疫学家 Kohler 和 Milstein 利用仙台病毒诱导绵羊红细胞免疫的小鼠脾细 胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，选择到能分泌单一抗体的杂种细胞。该杂种细胞具有在小鼠 体内和体外培养条件下大量繁殖的能力，并能长期地分泌单克隆抗体，从而建立了小鼠 淋巴细胞杂交瘤技术。这一技术的诞生把细胞融合技术从实验阶段推向了应用研究阶段， 促进了动物细胞工程的蓬勃发展。 四. 动物克隆技术的建立 1891，Heape 等人首次报道了家兔胚胎移植成功的结果，他们把安哥拉家兔胚胎移 植给比利时兔，得到了 4 只安哥拉家兔。 本世纪 30 年代以后，先后在羊、猪、牛等动物的胚胎移植上获得成功。经过几十年的 不断完善和充实，已成为一项比较成熟的繁殖生物学技术。 首例克隆动物成功的报道是在 1962 年，英国学者 Grudon 把非洲爪蟾小肠上皮细胞 的核注入同种或异种非洲爪蟾未受精卵(经紫外线照射杀死卵细胞核)中，约有 1％的重 组卵发育成为成熟蛙。 这一成功开创了由体细胞培育动物个体的新型实验途径，其贡献在于：实验证明了 4
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程 004-7 完全分化的肠细胞仍然具有未分化细胞的全部遗传信息,并能在一定的条件下发育成 动物个体,从而证明了动物细胞仍然具有全能性;初步建立了体细胞核移植的实验体 系,证明在体细胞核转至胚胎发育方向的早期,卵细胞质对体细胞核的发育功能起着 关键性的调节作用,其作用因子可能是细胞质中的mRMA与有关的蛋白质。 1997年2月,英国科学家 Wilmut等在世界权威杂志《 Nature》上首例报道了世界第 只克隆羊的诞生。它的贡献在于:实验证明了哺乳动物高度分化的细胞同样含有全套 遗传信息,亦能在一定条件下发育成动物个体,进一步证明了动物细胞的全能性 **多利诞生的技术路线 取6岁供体羊乳腺细胞一血清饥饿培养使细胞处于Go期 经GnRH处理取卵细胞一移去卵细胞的细胞核 将培养的乳腺细胞的核移植到去核的卵细胞中 重组细胞植入第一受体羊输卵管中培养至胚泡期(桑椹胚) 桑椹胚再移植入第二受体羊子宫内发育至分娩 第三节植物细胞工程的发展 植物细胞工程是一门以植物组织和细胞的离体操作为基础的实验性学科。它是以植 物组织细胞为基本单位,在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作,使细胞的某 些生物学特性按人们的意愿发生改变,从而改良品种或创造新物种,或加速繁殖植物个 体,或获得有用物质的过程统称为植物细胞工程。植物细胞工程是在植物组织培养的基 础上发展起来的,因此,植物细胞工程亦是广义概念上的植物组织培养。 探索阶段 在这一阶段中,细胞学说的产生和细胞全能性学说的提出为组织培养技术的产生奠 定了理论基础。在这些理论的指导下所开展的有关试验,对组织培养技术的建立进行了 有益的探索。 细胞学说( cell theory)是 Schleiden和 Chant分别于1838年和l839年提出的, 其核心内容是,细胞是有机体,亦是生物体的基本结构单位,由它构成整个生物个体 同时,植物细胞又是在生理和发育上具有潜在全能性的功能单位。随后,Schwωm在 1839年更明确的指出:“如果具有与有机体内一样的条件时,每个细胞应该可以独立 生活和发展”。这一论点已成为组织培养研究的思想基础 细胞全能性学说是德国著名植物学家G. Haberlandt在细胞学说的基础上于1902年提出 的。他认为,高等植物的组织、器官可以不断分割,直到单个细胞。如果每个细胞都有植 物个体一样的性质和能力,那么,可以通过植物细胞培养使单个细胞发育成为一个新个
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 完全分化的肠细胞仍然具有未分化细胞的全部遗传信息，并能在一定的条件下发育成 动物个体，从而证明了动物细胞仍然具有全能性；初步建立了体细胞核移植的实验体 系，证明在体细胞核转至胚胎发育方向的早期，卵细胞质对体细胞核的发育功能起着 关键性的调节作用，其作用因子可能是细胞质中的 mRNA 与有关的蛋白质。 1997 年 2 月，英国科学家 Wilmut 等在世界权威杂志《Nature》上首例报道了世界第 一只克隆羊的诞生。它的贡献在于：实验证明了哺乳动物高度分化的细胞同样含有全套 遗传信息，亦能在一定条件下发育成动物个体，进一步证明了动物细胞的全能性。 **多利诞生的技术路线： 取 6 岁供体羊乳腺细胞 — 血清饥饿培养使细胞处于 G0期 经 GnRH 处理取卵细胞 — 移去卵细胞的细胞核 将培养的乳腺细胞的核移植到去核的卵细胞中 重组细胞植入第一受体羊输卵管中培养至胚泡期(桑椹胚) 桑椹胚再移植入第二受体羊子宫内发育至分娩 第三节 植物细胞工程的发展 植物细胞工程是一门以植物组织和细胞的离体操作为基础的实验性学科。它是以植 物组织细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某 些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个 体，或获得有用物质的过程统称为植物细胞工程。植物细胞工程是在植物组织培养的基 础上发展起来的，因此，植物细胞工程亦是广义概念上的植物组织培养。 一．探索阶段 在这一阶段中，细胞学说的产生和细胞全能性学说的提出为组织培养技术的产生奠 定了理论基础。在这些理论的指导下所开展的有关试验，对组织培养技术的建立进行了 有益的探索。 细胞学说（cell theory）是 Schleiden 和 Schwann 分别于 1838 年和 1839 年提出的， 其核心内容是，细胞是有机体，亦是生物体的基本结构单位，由它构成整个生物个体。 同时，植物细胞又是在生理和发育上具有潜在全能性的功能单位。随后，Schwann 在 1839 年更明确的指出：“如果具有与有机体内一样的条件时，每个细胞应该可以独立 生活和发展”。这一论点已成为组织培养研究的思想基础。 细胞全能性学说是德国著名植物学家 G. Haberlandt 在细胞学说的基础上于 1902 年提出 的。他认为，高等植物的组织、器官可以不断分割，直到单个细胞。如果每个细胞都有植 物个体一样的性质和能力，那么，可以通过植物细胞培养使单个细胞发育成为一个新个 体。 5