华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程 004-7 培养技术建立阶段 作为一门技术,它必须具有一定的程序性。也就是说,它应该具有一定的技术模式。 在这一阶段,植物组织培养建立了两个与培养技术有关的重要模式,一是培养基模式, 二是激素调控模式。 应用研究阶段 其一,组织培养领域的研究迅速在世界各国的有关实验室广泛展开 其二,技术体系更加完善。这一阶段的技术体系包括:根据不同的培养目的外植体 的取材和灭菌方法,不同外植体及其培养产物的培养程序,适合于不同植物种类和外植 体类型的培养基等。 其三,形成了较为完整的理论体系。在植物组织培养硏究的基础上,植物细胞工程 现已形成了以细胞全能性为基本理论基础,以细胞脱分化和再分化调控为中心的理论体 系。 其四,研究目的性更加明确,并已广泛应用到生物科学研究的各个领域,以细胞工 程为基础的新型生物技术产业正在兴起 四.植物细胞工程应用 在植物育种上的应用 将常规植物育种技术与植物组织培养技术相结合,可以获得常规技术难以或无法获 得的种质材料,缩短育种周期,提高育种效率。 快速获得特殊倍性材料;克服远缘杂交不亲和;克服杂种胚早期夭折;导入外源基 因;突变体筛选;种质资源保存 种苗脱病毒与快速繁殖 细胞培养生产有用次生产物 在细胞生物学和发育生物学研究中的应用 在植物遗传、生理生化以及植物病理等基础研究中的应用 思考题 1.细胞工程的概念、研究范畴、在生命科学中与其它学科的关系。 2.动物细胞工程发展的主要标志性阶段 3.植物细胞工程技术的发展阶段与标志性成就。 4.植物细胞工程的作用与应用领域
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 二．培养技术建立阶段 作为一门技术，它必须具有一定的程序性。也就是说，它应该具有一定的技术模式。 在这一阶段，植物组织培养建立了两个与培养技术有关的重要模式，一是培养基模式， 二是激素调控模式。 三．应用研究阶段 其一，组织培养领域的研究迅速在世界各国的有关实验室广泛展开。 其二，技术体系更加完善。这一阶段的技术体系包括：根据不同的培养目的外植体 的取材和灭菌方法，不同外植体及其培养产物的培养程序，适合于不同植物种类和外植 体类型的培养基等。 其三，形成了较为完整的理论体系。在植物组织培养研究的基础上，植物细胞工程 现已形成了以细胞全能性为基本理论基础，以细胞脱分化和再分化调控为中心的理论体 系。 其四，研究目的性更加明确，并已广泛应用到生物科学研究的各个领域，以细胞工 程为基础的新型生物技术产业正在兴起。 四．植物细胞工程应用 在植物育种上的应用 将常规植物育种技术与植物组织培养技术相结合，可以获得常规技术难以或无法获 得的种质材料，缩短育种周期，提高育种效率。 快速获得特殊倍性材料；克服远缘杂交不亲和；克服杂种胚早期夭折；导入外源基 因；突变体筛选；种质资源保存 种苗脱病毒与快速繁殖 细胞培养生产有用次生产物 在细胞生物学和发育生物学研究中的应用 在植物遗传、生理生化以及植物病理等基础研究中的应用 思考题 1．细胞工程的概念、研究范畴、在生命科学中与其它学科的关系。 2．动物细胞工程发展的主要标志性阶段。 3．植物细胞工程技术的发展阶段与标志性成就。 4．植物细胞工程的作用与应用领域。 6
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程 004-7 主讲教师:柳俊博士、教授 第一章实验室设置及一般技术(2学时) 教学目的与要求 了解细胞工程的通用技术,初步掌握细胞工程实验技术中的培养基配制、灭菌以及 无菌操作的原理与操作方法 第一节实验室设置 细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要,即:实验准备,包括培养基配制,洗 涤与灭菌等:无菌操作;控制培养 实验室组成 1.基本实验室 准备室准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮,通风 条件好。 接种室接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好,干燥清洁,能较长时间保 持无菌。房间一般不宜过大,其规模根据实验需要而定。接种室除了出入口和通气口外 应行密闭。 培养室培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和 温度,其次为防止微生物感染,培养室应保持干燥和清洁 2.辅助实验室 细胞学实验室其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥, 使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染 摄影室及暗室其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下 可建立此实验室。 生化分析室在以培养细胞产物为主要目的的实验室中,应建立相应的分析化验 实验室,以便于对培养物的有效成分随时进行取样检査 细胞工程实验室布局的其基本要求是:便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察。 基本设备配制 基本设备冰箱、天平、酸度计、、纯水器、电炉、培养基分装器、搅拌器 灭菌设备蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯 无菌操作设备净化工作台、接种箱
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 第一章 实验室设置及一般技术（2 学时） 教学目的与要求： 了解细胞工程的通用技术，初步掌握细胞工程实验技术中的培养基配制、灭菌以及 无菌操作的原理与操作方法。 第一节 实验室设置 细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即：实验准备，包括培养基配制，洗 涤与灭菌等；无菌操作；控制培养。 一．实验室组成 1．基本实验室 准备室 准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风 条件好。 接种室 接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保 持无菌。房间一般不宜过大，其规模根据实验需要而定。接种室除了出入口和通气口外， 应行密闭。 培养室 培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和 温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。 2．辅助实验室 细胞学实验室 其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥， 使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。 摄影室及暗室 其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下 可建立此实验室。 生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验 实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。 细胞工程实验室布局的其基本要求是：便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察。 二．基本设备配制 基本设备 冰箱、天平、酸度计、、纯水器、电炉、培养基分装器、搅拌器。 灭菌设备 蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。 无菌操作设备 净化工作台、接种箱。 7
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程 004-7 光温控制设备时间程序控制器、空调及温度感应器。 细胞培养设备培养设备根据需要而定,包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。 细胞学鉴定设备光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜 除上述基本设备外,如果有条件和需要还可配制摄影设备、生化分析设备等。 三.培养器皿及实验用具 玻璃器皿 新型材料器皿 金属材质用具 第二节基本技术 洗涤技术 1.洗涤液 铬酸洗涤液是用重铬酸钾( K2 Cr2O7)与硫酸(HSO4)配制而成,可根据需要配制成弱 中、强三种。 弱用重铬酸钾50g加入蒸馏水1L,加热溶化,冷却后再缓慢加入浓硫酸9ml。 中用重铬酸钾50g加入蒸馏水l00m,加热溶化,冷却后再缓慢加入浓硫酸 875ml 强与浓硫酸加热的同时缓慢加入磨碎的重铬酸钾,直到重铬酸钾达到饱和为止。 一般浓硫酸LL加入重铬酸钾50g。 2.洗涤方法 玻璃器皿洗涤 塑料用品洗涤 金属用品洗涤 灭菌、消毒技术 理方法:物理灭菌干热、湿热、射线处理 物理除菌过滤、离心沉淀等 化学方法:消毒剂、抗菌素灭菌 1.培养基灭菌 2.玻璃器皿灭菌 3.金属用具灭菌
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 光温控制设备 时间程序控制器、空调及温度感应器。 细胞培养设备 培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。 细胞学鉴定设备 光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜。 除上述基本设备外，如果有条件和需要还可配制摄影设备、生化分析设备等。 三．培养器皿及实验用具 玻璃器皿 新型材料器皿 金属材质用具 第二节 基本技术 一．洗涤技术 1．洗涤液 铬酸洗涤液是用重铬酸钾(K2Cr2O7)与硫酸(H2SO4)配制而成，可根据需要配制成弱、 中、强三种。 弱 用重铬酸钾 50g 加入蒸馏水 1L，加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸 90ml。 中 用重铬酸钾 50g 加入蒸馏水 100ml，加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸 875ml。 强 与浓硫酸加热的同时缓慢加入磨碎的重铬酸钾，直到重铬酸钾达到饱和为止。 一般浓硫酸 1L 加入重铬酸钾 50g。 2．洗涤方法 玻璃器皿洗涤 塑料用品洗涤 金属用品洗涤 二．灭菌、消毒技术 理方法：物理灭菌 干热、湿热、射线处理 物理除菌 过滤、离心沉淀等 化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌 1．培养基灭菌 2．玻璃器皿灭菌 3．金属用具灭菌 8
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程 004-7 4.接种室灭菌 5.外植体灭菌 几种常用消毒剂的效果比较 消毒剂使用浓度(%)消毒时间(分)效果残液去除难易 次氯酸钙 10 次氯酸钠 30 新洁尔灭 30 好好好 易易易 氯化汞 0.1 2~10 最好 最难 过氧化氢 15 较好 最易 抗菌素 4-50mgl-l 30~60 较好 较难 第三节培养条件 光照 1.光照强度 2.光质 3.光照时间 温度 表1.2温度对菊芋愈伤组织细胞生长的影响 培养温度()接种时单个细胞平均鲜重(微到指数生长期末单个细胞重微克 克) 10.0 0.44 0.20 0 250 300 0.42 0.06 32.0 0.03 湿度 组织培养中湿度的影响有两个方面,一是培养容器内的湿度条件,一是环境的湿 度条件。容器内的湿度几乎是100%的相对湿度,二是环境的相对湿度一般要求70~ 四.pH值 通常使用的pH值范围是55~65。pH在40以下或70以上培养物就不能正常生长
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 4．接种室灭菌 5．外植体灭菌 几种常用消毒剂的效果比较 消 毒 剂 使用浓度(％) 消毒时间(分) 效 果 残液去除难易 次氯酸钙 10 5～30 好 易 次氯酸钠 2～5 5～30 好 易 新洁尔灭 10～20 5～30 好 易 氯化汞 0.1～1 2～10 最好 最难 过氧化氢 10～12 5～15 较好 最易 抗菌素 4～50mgl -1 30～60 较好 较难 第三节 培养条件 一．光照 1．光照强度 2．光质 3．光照时间 二．温度 表 1.2 温度对菊芋愈伤组织细胞生长的影响 培养温度( ) 接种时单个细胞平均鲜重(微 克) 到指数生长期末单个细胞重(微克) 10.0 0.44 0.20 15.0 0.42 0,12 25.0 0.44 0.07 30.0 0.42 0.06 32.0 0.52 0.03 三．湿度 组织培养中湿度的影响有两个方面，一是培养容器内的湿度条件，一是环境的湿 度条件。容器内的湿度几乎是 100%的相对湿度，二是环境的相对湿度一般要求 70～ 80%。 四．pH 值 通常使用的 pH 值范围是 5.5～6.5。pH 在 4.0 以下或 7.0 以上培养物就不能正常生长。 9
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程 004-7 五.渗透压 通气条件 第四节离体培养的营养需求 总体来讲用于植物离体培养的培养基至少包括无机盐;有机化合物;生长调节剂 三大基本组成以及根据不同需要的其它附加成分。 无机盐类 必需元素在体内的生理作用主要包括四个方面: 是组成各种化合物,参与机体的建造,成为结构物质; 二是构成一些特殊的生理活性物质,如植物激素、酶以及酶的活化剂,参与植物的 代谢活动 三是这些元素之间相互协调,以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等生物电化 学方面的作用 四是在发育过程中,影响组织器官的建成。 有机化合物 糖类既可作为C源,又可维持培养基的渗透压。植物组织培养中常使用蔗糖,在 某些特殊培养类型中,亦使用麦芽糖、葡萄糖、果糖、纤维二糖、甘露糖等。 维生素为了使培养物生长得更好,根据培养目的不同常在培养基中添加一种或 多种维生素。常用的维生素包括VB1(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸) VH(生物素)、ⅤBc(叶酸)、VB3(泛酸钙)等 肌醇化学名称环己六醇。肌醇本身并没有促进生长的作用,但它在糖类的相互转 化、维生素、激素的利用相应具有重要的促进作用,所以它能使培养物快速生长,对胚 状体和芽的形成有良好的影响。 腺嘌呤腺嘌呤是合成各种细胞分裂素的前体之一,外源添加腺嘌呤有利于细胞 协调自身合成细胞分裂素,有利于细胞的分裂和分化,促进芽的形成和生长 氨基酸氨基酸是蛋白质的组成成分。常用的氨基酸为甘氨酸及多种氨基酸的混合 物如水解酪蛋白、水解乳蛋白等。 植物激素 生长素类常用的生长素有IAA(吲哆乙酸)、NAA(奈乙酸)、2,4-D(二氯苯氧乙酸)
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 2004-7 主讲教师：柳俊博士、教授 五．渗透压 六．通气条件 第四节 离体培养的营养需求 总体来讲用于植物离体培养的培养基至少包括无机盐；有机化合物；生长调节剂 三大基本组成以及根据不同需要的其它附加成分。 一．无机盐类 必需元素在体内的生理作用主要包括四个方面： 一是组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质； 二是构成一些特殊的生理活性物质，如植物激素、酶以及酶的活化剂，参与植物的 代谢活动； 三是这些元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等生物电化 学方面的作用； 四是在发育过程中，影响组织器官的建成。 二．有机化合物 糖类 既可作为 C 源，又可维持培养基的渗透压。植物组织培养中常使用蔗糖，在 某些特殊培养类型中，亦使用麦芽糖、葡萄糖、果糖、纤维二糖、甘露糖等。 维生素 为了使培养物生长得更好，根据培养目的不同常在培养基中添加一种或 多种维生素。常用的维生素包括 VB1（盐酸硫胺素）、VB6（盐酸吡哆醇）、Vpp(烟酸)、 VH (生物素)、VBc（叶酸）、VB5（泛酸钙）等。 肌醇 化学名称环己六醇。肌醇本身并没有促进生长的作用，但它在糖类的相互转 化、维生素、激素的利用相应具有重要的促进作用，所以它能使培养物快速生长，对胚 状体和芽的形成有良好的影响。 腺嘌呤 腺嘌呤是合成各种细胞分裂素的前体之一，外源添加腺嘌呤有利于细胞 协调自身合成细胞分裂素，有利于细胞的分裂和分化，促进芽的形成和生长。 氨基酸 氨基酸是蛋白质的组成成分。常用的氨基酸为甘氨酸及多种氨基酸的混合 物如水解酪蛋白、水解乳蛋白等。 三．植物激素 生长素类 常用的生长素有 IAA(吲哆乙酸)、NAA (奈乙酸 )、2,4-D(二氯苯氧乙酸) 10