华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第三章) 主讲教师:柳俊博士、教授 第三章离体培养下的遗传与变异(5学时) 教学目的与要求 掌握离体培养中体细胞变异的特点和规律;了解体细胞变异的细胞遗传学和分子遗传学 基础;掌握体细胞变异的应用途径和选择方法。 细胞组织的离体培养属于无性繁殖范畴。从理论上来说,无论是细胞还是组织培养 再生的个体均承传了母体的遗传基础,这也是离体培养技术作为植物快速繁殖应用的基 由于培育过程的影响,离体培养的细胞、愈伤组织以及再生植株均普遍存在着变异。 由于离体培养条件下并没有发生雌雄配子的受精,因此, Larkin和 Scowcroft(1981)提出 把由任何形式的细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系( somaclones),而把这些植 株所表现出来的变异称之为体细胞无性系变异( somaclonal variation) 就对生物遗传的影响而言,细胞工程技术本身包含了双重性:遗传的稳定性和变异 性 第一节离体培养中的遗传与变异特点 离体培养中的遗传稳定性 离体培养的细胞学基础是有丝分裂。有丝分裂的DNA半保留复制和染色体均等分裂机 制,从理论上可以保证离体培养物在一般情况下的遗传稳定性。 在准确选择培养方式的前提下,离体无性繁殖可以具有较高的遗传稳定性( Phillip 等,1994)。正是基于这一理论,利用离体培养技术建立了多种植物的无性繁殖体系。 离体培养的遗传稳定性表现的另一个方面是,即使发生某些变异,也可以即时淘汰变 异 、离体培养条件下遗传变异的特点 普遍性 变异可发生在各种培养类型中; 变异发生在各种植物的培养中 变异发生与培养类型有关。 表3.1部分植物离体培养再生植株的表型变异频率* 植物种类 再生植株来源 变异频率(%) 体细胞愈伤组织10 水稻 胚愈伤组织 719 甘蔗 幼叶愈伤组织 18 玉米 体细胞愈伤组织 蔓青 花粉植株 12.7
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第三章) 主讲教师：柳俊博士、教授 第三章 离体培养下的遗传与变异（5 学时） 教学目的与要求： 掌握离体培养中体细胞变异的特点和规律；了解体细胞变异的细胞遗传学和分子遗传学 基础；掌握体细胞变异的应用途径和选择方法。 细胞组织的离体培养属于无性繁殖范畴。从理论上来说，无论是细胞还是组织培养， 再生的个体均承传了母体的遗传基础，这也是离体培养技术作为植物快速繁殖应用的基 础。 由于培育过程的影响，离体培养的细胞、愈伤组织以及再生植株均普遍存在着变异。 由于离体培养条件下并没有发生雌雄配子的受精，因此，Larkin 和 Scowcroft（1981）提出 把由任何形式的细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系（somaclones），而把这些植 株所表现出来的变异称之为体细胞无性系变异（somaclonal variation）。 就对生物遗传的影响而言，细胞工程技术本身包含了双重性：遗传的稳定性和变异 性。 第一节 离体培养中的遗传与变异特点 一、离体培养中的遗传稳定性 离体培养的细胞学基础是有丝分裂。有丝分裂的 DNA 半保留复制和染色体均等分裂机 制，从理论上可以保证离体培养物在一般情况下的遗传稳定性。 在准确选择培养方式的前提下，离体无性繁殖可以具有较高的遗传稳定性（Phillip 等，1994）。正是基于这一理论，利用离体培养技术建立了多种植物的无性繁殖体系。 离体培养的遗传稳定性表现的另一个方面是，即使发生某些变异，也可以即时淘汰变 异。 二、离体培养条件下遗传变异的特点 普遍性： 变异可发生在各种培养类型中； 变异发生在各种植物的培养中； 变异发生与培养类型有关。 表 3.1 部分植物离体培养再生植株的表型变异频率* 植 物 种 类 再生植株来源 变异频率（％） 烟 草 体细胞愈伤组织 10 水 稻 胚愈伤组织 71.9 甘 蔗 幼叶愈伤组织 >18 玉 米 体细胞愈伤组织 14 蔓 青 花粉植株 12.7
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第三章) 主讲教师:柳俊博士、教授 大麦 花粉植株 0-15 幼叶愈伤组织 马铃薯 肉原生质体 菠萝 冠芽愈伤组织 7 腋芽愈伤组织 裔芽愈伤组织 伤组织 100 引自李宝健和曾庆平,1990 局限性: 从表型上看,在不同植物类型中经常发生的体细胞变异主要是植株形态(株高、叶 形、叶色等)、生长势、育性、某些抗性等性状的变异。 从生理生化特性上看,容易出现同功酶谱、次生代谢的消长等变异。 些单基因控制的性状不仅发生隐形突变,也发生显性突变。 嵌合性: 嵌合性是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞,它是组织培养中常见的现 表3.2 Triticum durun6个无性系植株体细胞染色体数* 括号外为个体数,括号内为染色体数) 序号2n<142n=142n=15~27 282n=29~552n=562n>58 1(7) 737(16~24,26) 8(29.39.4 35(17,20,23)111(33) 5(9,11,621(15,18,21 12) 27) 3(7) 4(16,21,2,223 27) 51(11)65(15.22.26)14 (32) 18(18,20~26)21 (40) 引自张冬生,1989。 、影响体细胞遗传与变异的因素 供体植物 供体植物倍性水平;基因型;外植体细胞分化程度 表3.3谷子体细胞无性系R2的变异频率* R2未变异株系变异株系 总变 基因型株系株系百分稳定变%分离变%异 数 %异
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第三章) 主讲教师：柳俊博士、教授 大 麦 花粉植株 10-15 番 茄 幼叶愈伤组织 >5.8 马铃薯 叶肉原生质体 100 菠 萝 冠芽愈伤组织 7 腋芽愈伤组织 34 裔芽愈伤组织 98 幼果愈伤组织 100 * 引自李宝健和曾庆平，1990。 局限性： 从表型上看，在不同植物类型中经常发生的体细胞变异主要是植株形态（株高、叶 形、叶色等）、生长势、育性、某些抗性等性状的变异。 从生理生化特性上看，容易出现同功酶谱、次生代谢的消长等变异。 一些单基因控制的性状不仅发生隐形突变，也发生显性突变。 嵌合性： 嵌合性是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞，它是组织培养中常见的现 象。 表 3.2 Triticum durum 6 个无性系植株体细胞染色体数* （括号外为个体数，括号内为染色体数） 序号 2n<14 2n=14 2n=15～27 2n=28 2n=29～55 2n=56 2n>58 1 1（7） 7 37（16～24, 26） 76 8（29, 39, 40） 4 2 2 3 5（17, 20, 23） 11 1（33） 1 3 5（9, 11, 12） 6 21（15,18,21～ 27） 33 3 4 3（7） 1 4（16, 21, 22, 27） 22 3 5 1（11） 6 5（15, 22, 26） 14 1（32） 6 2（12） 1 18（18, 20～26） 21 1（40） 2 * 引自张冬生，1989。 三、影响体细胞遗传与变异的因素 1．供体植物 供体植物倍性水平；基因型；外植体细胞分化程度 表 3.3 谷子体细胞无性系 R2 的变异频率* 基因型 R2 株系 数 未变异株系 变 异 株 系 株系 数 百分 率％ 稳定变 异 ％ 分离变 异 ％ 总变 异 ％
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第三章) 主讲教师:柳俊博士、教授 豫谷1号21020195.7009434.3 豫谷5号120 4.211 高39 170 1528943 15 8.810.6 郑407 121 11090.93 2.58 6.69.1 冀谷145539 70.94 7312 21.829.1 32932 C445 100 83 83.06 6.011 110170 矮宁黄 引自刁现民等,2002。 2.培养基及培养方式 不同的激素浓度可以有选择地诱导不同倍性的细胞的分裂。 激素除了引起染色体倍性的增加外,在一些培养中还发现染色体倍性减少的现象。 培养基的物理状态以及培养类型也会引起细胞的变异。一般来讲,悬浮培养的细胞较 半固体培养的细胞易产生变异。 3.继代培养的次数 般来讲,继代时间越长,继代次数越多,细胞变异的几率就越高。 表34培养时间对掌叶半夏愈伤组织染色体变异的影响* 培养时 亚二倍体 二倍体 多倍体和非整倍 观察细胞数 体 (月) 细胞百分细胞%6细胞%6 率% 152 65 70.79 3 l1.8 76.56 118 12 30.0 54.07 14.0 39819 22.9 *引自李亮亮等,1998。 第二节体细胞变异的细胞遗传学基础 DNA核内重复复制 DNA在核内重复复制( endoreduplication)但不发生细胞分裂,其结果是染色体组数增 加,形成同源多倍体。如果这种DNA重复复制多次发生,细胞内DNA含量就会不断上 表35硬粒小麦中胚轴培养中DNA值的变化* 不同DNA值细胞比例(%) 培养天数<2 <8c 8c或>8 5 80.7 16.8 2.5 4.8 795 6.6 79 0.9 引自张冬生,1989
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第三章) 主讲教师：柳俊博士、教授 豫谷 1 号 豫谷 5 号 高 39 郑 407 冀谷 14 号 C445 矮宁黄 210 120 170 121 55 70 100 201 104 152 110 39 47 83 95.7 86.7 89.4 90.9 70.9 67.1 83.0 0 5 3 3 4 0 6 0 4.2 8 2.5 7.3 0 6.0 9 11 15 8 12 23 11 4.3 9.1 8.8 6.6 21.8 32.9 11.0 4.3 13.3 10.6 9.1 29.1 32.9 17.0 * 引自刁现民等，2002。 2．培养基及培养方式 不同的激素浓度可以有选择地诱导不同倍性的细胞的分裂。 激素除了引起染色体倍性的增加外，在一些培养中还发现染色体倍性减少的现象。 培养基的物理状态以及培养类型也会引起细胞的变异。一般来讲，悬浮培养的细胞较 半固体培养的细胞易产生变异。 3．继代培养的次数 一般来讲，继代时间越长，继代次数越多，细胞变异的几率就越高。 表 3.4 培养时间对掌叶半夏愈伤组织染色体变异的影响* 培养时 间 （月） 观察细胞数 亚二倍体 二倍体 多倍体和非整倍 体 细胞 数 百分 率％ 细胞 数 ％ 细胞 数 ％ 1 3 12 18 92 51 50 83 14 6 15 29 15.2 11.8 30.0 34.9 65 39 27 33 70.7 76.5 54.0 39.8 9 6 7 19 9.8 11.8 14.0 22.9 * 引自李亮亮等，1998。 第二节 体细胞变异的细胞遗传学基础 一、DNA 核内重复复制 DNA 在核内重复复制（endoreduplication）但不发生细胞分裂，其结果是染色体组数增 加，形成同源多倍体。如果这种 DNA 重复复制多次发生，细胞内 DNA 含量就会不断上 升。 表 3.5 硬粒小麦中胚轴培养中 DNA 值的变化* 培养天数 不同 DNA 值细胞比例（％） <2c 2c～4c <8c 8c 或 >8c 0 88.3 11.7 5 80.7 16.8 2.5 13 4.8 79.5 6.6 9.1 17 9.7 81.5 7.9 0.9 * 引自张冬生，1989
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第三章) 主讲教师:柳俊博士、教授 染色体断裂与重组 染色体结构变异是体细胞变异的另一重要类型。染色体断裂与重组是离体培养中染色 体结构变异的主要原因之一,也是体细胞变异中经常发生的现象 染色体结构变异的细胞学特征是,分裂中期出现断裂的染色体片段、落后染色体以及 染色体桥,其结果是在体细胞中出现染色体易位、缺失、倒位等多种类型的结构变异 、非正常有丝分裂 离体培养中,染色体除了整倍性变异外,还可观察到大量的非整倍性变异,这种愈伤 组织往往分化能力低下,再生植株大多生长不正常,有性繁殖的遗传稳定性差。纺锤体形 成异常使得有丝分裂不正常是其原因之 非正常有丝分裂包括多极纺锤体形成和核裂。 第三节体细胞变异的分子遗传学基础 、碱基突变 碱基突变是指DNA序列中碱基的改变。如果改变碱基的DNA序列处于结构基因的位 置或调控序列的位置,就可能导致遗传状态的改变。碱基突变是产生体细胞变异的重要途 径之 对于单基因控制的遗传性状,大多数碱基突变可以稳定遗传,而且符合孟德尔遗传分 离规律,这一点已在水稻、烟草和玉米的体细胞变异中得以证实(张春义和杨汉民, 1994) 、DNA序列的选择性扩增与丢失 在许多植物中均观察到,DNA分子中一些重复序列在培养条件下发生了扩增。 Capitan 等(1988)以生物素标记的480bp重复序列DNA片段为探针,发现小黑麦杂种再生植株当 代限R染色体短臂端粒位置上的这种重复序列发生了扩增,而且这种扩增可以遗传至少三 在许多植物种类中还观察到,在组织培养过程中,以及经组织培养再生的植株,甚至 在这些植株的后代中,有时也会发生DNA序列丢失的现象。 现有资料显示,DNA序列丢失多发生在rDNA及其间隔序列,某些重复序列DNA区 域也易发生丢失 研究还发现,DNA的减少不仅发生在核DNA中,也有发生在叶绿体基因组中。一些 DNA序列的减少只发生在愈伤组织形成阶段,植株再生过程中又恢复到正常状态,目前还 不清楚这种变化的生物学意义 转座子活化 转座子( transposon)首先是由 McClintock在玉米中发现的,现已证实它是引起许多遗 传不稳定现象的重要原因。 上个世纪80年代, Larkin和 Scowcroft首先提出,转座因子的活化可能是体细胞无性系 变异的原因之 我国学者朱至清(1991)认为,也可能是转座子在培养环境中首先被激活而转座,从 而造成染色体的结构变异
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第三章) 主讲教师：柳俊博士、教授 二、染色体断裂与重组 染色体结构变异是体细胞变异的另一重要类型。染色体断裂与重组是离体培养中染色 体结构变异的主要原因之一，也是体细胞变异中经常发生的现象。 染色体结构变异的细胞学特征是，分裂中期出现断裂的染色体片段、落后染色体以及 染色体桥，其结果是在体细胞中出现染色体易位、缺失、倒位等多种类型的结构变异。 三、非正常有丝分裂 离体培养中，染色体除了整倍性变异外，还可观察到大量的非整倍性变异，这种愈伤 组织往往分化能力低下，再生植株大多生长不正常，有性繁殖的遗传稳定性差。纺锤体形 成异常使得有丝分裂不正常是其原因之一。 非正常有丝分裂包括多极纺锤体形成和核裂。 第三节 体细胞变异的分子遗传学基础 一、碱基突变 碱基突变是指 DNA 序列中碱基的改变。如果改变碱基的 DNA 序列处于结构基因的位 置或调控序列的位置，就可能导致遗传状态的改变。碱基突变是产生体细胞变异的重要途 径之一。 对于单基因控制的遗传性状，大多数碱基突变可以稳定遗传，而且符合孟德尔遗传分 离规律，这一点已在水稻、烟草和玉米的体细胞变异中得以证实（张春义和杨汉民， 1994）。 二、DNA 序列的选择性扩增与丢失 在许多植物中均观察到，DNA 分子中一些重复序列在培养条件下发生了扩增。Lapitan 等（1988）以生物素标记的 480 bp 重复序列 DNA 片段为探针，发现小黑麦杂种再生植株当 代 7R 染色体短臂端粒位置上的这种重复序列发生了扩增，而且这种扩增可以遗传至少三 代。 在许多植物种类中还观察到，在组织培养过程中，以及经组织培养再生的植株，甚至 在这些植株的后代中，有时也会发生 DNA 序列丢失的现象。 现有资料显示，DNA 序列丢失多发生在 rDNA 及其间隔序列，某些重复序列 DNA 区 域也易发生丢失。 研究还发现，DNA 的减少不仅发生在核 DNA 中，也有发生在叶绿体基因组中。一些 DNA 序列的减少只发生在愈伤组织形成阶段，植株再生过程中又恢复到正常状态，目前还 不清楚这种变化的生物学意义。 三、转座子活化 转座子（transposon）首先是由 McClintock 在玉米中发现的，现已证实它是引起许多遗 传不稳定现象的重要原因。 上个世纪 80 年代，Larkin 和 Scowcroft 首先提出，转座因子的活化可能是体细胞无性系 变异的原因之一。 我国学者朱至清（1991）认为，也可能是转座子在培养环境中首先被激活而转座，从 而造成染色体的结构变异
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第三章) 主讲教师:柳俊博士、教授 目前关于转座子引起体细胞变异的直接实验证据还十分有限,但许多学者认为,用转 座子解释体细胞变异有许多合理性,如变异频率高、沉默基因活化等。因此,有关转座子 在体细胞无性系变异中的作用,也是将来体细胞遗传变异研究的热点 四、DNA甲基化 DNA甲基化( methylation)在基因表达调控中具有重要作用。 离体培养再生植株的甲基化变化首先在玉米体细胞无性系再生植株中发现。来自玉米 幼胚再生植株的某些无性系与供体相比发生了超甲基化,而另一些再生植株却只在与G相 邻的C上发生甲基化,而且这种甲基化在基因组中的分布是不均匀的 胡萝卜、番茄、马铃薯等多种植物的培养细胞或再生植株中,均报道发现了因DNA甲 基化改变而产生的体细胞变异(刁现民和孙敬三,1994) 除了DNA甲基化程度的增加外,离体培养中的某些变异还来自于DNA甲基化程度的 降低。最典型的例子是油棕体细胞胚植株由于甲基化的减少而造成的雄蕊雌性化变异 ( Rival,1997)。 第四节体细胞无性系变异的诱导与选择 体细胞无性系变异的表示方法主要有两种: 种是 Chaleff(1981)提出的以R0、R1、R2、…分别代表体细胞无性系变异的当代 和自交以后的世代 另一种是由 Larkin和 Scowcroft(1983)提出的以SCl、RC2、RC3、…来分别代表体 细胞无性系变异的当代和自交以后的世代。现在,这两种表述方式在体细胞无性系变异研 究中均有应用 离体条件下的体细胞无性系变异的筛选有以下一些明显的优点 (1)由于筛选可以在离体条件下进行,从而可以在小空间内对大量个体进行选择。 (2)细胞突变体的筛选可以在几个细胞周期内完成,且不受季节限制,因此筛选效率 高 (3)因为试验是在人工设计的培养条件下进行的,因此诱变和筛选条件可以根据需要 进行调节和控制,从而提高了试验的重复性。 (4)由于变异是在单细胞水平上进行的,因此,一个突变体就是来自一个细胞,不会 有非突变细胞的干扰,避免了整体植株水平上无性变异常呈现出的嵌合体,因而可以省去 变异分离的麻烦。 (5)在细胞培养系统中,理化诱变剂可较均匀地接触细胞,因此可以引起培养细胞相 对较高频率地发生突变,增加了选择机会 体细胞变异诱导材料的选择 选择起始材料需根据试验目标确定,一般需考虑以下几方面的问题: 其一,目标性状的可行性。体细胞突变的频率虽然较高,但对于某一个体来讲,变异 的性状是个别的,因此选择综合性状良好的植物品种材料,通过诱变改变个别不良性状, 是体细胞突变系选择的目的 其二,必需充分考虑试验植物的细胞培养技术水平,只有对起始材料有良好的培养技 术,才有可能制定完满的诱变及选择方案。如果起始细胞的培养技术不成熟,不能再生整 株,则不能进行后续的各项操作。 其三,适当的细胞类型亦是提高体细胞突变系筛选效率的重要条件
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第三章) 主讲教师：柳俊博士、教授 目前关于转座子引起体细胞变异的直接实验证据还十分有限，但许多学者认为，用转 座子解释体细胞变异有许多合理性，如变异频率高、沉默基因活化等。因此，有关转座子 在体细胞无性系变异中的作用，也是将来体细胞遗传变异研究的热点。 四、DNA 甲基化 DNA 甲基化（methylation）在基因表达调控中具有重要作用。 离体培养再生植株的甲基化变化首先在玉米体细胞无性系再生植株中发现。来自玉米 幼胚再生植株的某些无性系与供体相比发生了超甲基化，而另一些再生植株却只在与 G 相 邻的 C 上发生甲基化，而且这种甲基化在基因组中的分布是不均匀的。 胡萝卜、番茄、马铃薯等多种植物的培养细胞或再生植株中，均报道发现了因 DNA 甲 基化改变而产生的体细胞变异（刁现民和孙敬三，1994）。 除了 DNA 甲基化程度的增加外，离体培养中的某些变异还来自于 DNA 甲基化程度的 降低。最典型的例子是油棕体细胞胚植株由于甲基化的减少而造成的雄蕊雌性化变异。 （Rival，1997）。 第四节 体细胞无性系变异的诱导与选择 体细胞无性系变异的表示方法主要有两种： 一种是 Chaleff（1981）提出的以 R0、R1、R2、…分别代表体细胞无性系变异的当代 和自交以后的世代； 另一种是由 Larkin 和 Scowcroft（1983）提出的以 SC1、RC2、RC3、…来分别代表体 细胞无性系变异的当代和自交以后的世代。现在，这两种表述方式在体细胞无性系变异研 究中均有应用。 离体条件下的体细胞无性系变异的筛选有以下一些明显的优点： （1）由于筛选可以在离体条件下进行，从而可以在小空间内对大量个体进行选择。 （2）细胞突变体的筛选可以在几个细胞周期内完成，且不受季节限制，因此筛选效率 高。 （3）因为试验是在人工设计的培养条件下进行的，因此诱变和筛选条件可以根据需要 进行调节和控制，从而提高了试验的重复性。 （4）由于变异是在单细胞水平上进行的，因此，一个突变体就是来自一个细胞，不会 有非突变细胞的干扰，避免了整体植株水平上无性变异常呈现出的嵌合体，因而可以省去 变异分离的麻烦。 （5）在细胞培养系统中，理化诱变剂可较均匀地接触细胞，因此可以引起培养细胞相 对较高频率地发生突变，增加了选择机会。 一、体细胞变异诱导材料的选择 选择起始材料需根据试验目标确定，一般需考虑以下几方面的问题： 其一，目标性状的可行性。体细胞突变的频率虽然较高，但对于某一个体来讲，变异 的性状是个别的，因此选择综合性状良好的植物品种材料，通过诱变改变个别不良性状， 是体细胞突变系选择的目的。 其二，必需充分考虑试验植物的细胞培养技术水平，只有对起始材料有良好的培养技 术，才有可能制定完满的诱变及选择方案。如果起始细胞的培养技术不成熟，不能再生整 株，则不能进行后续的各项操作。 其三，适当的细胞类型亦是提高体细胞突变系筛选效率的重要条件