华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第四章) 主讲教师:柳俊博士、教授 第四章植物主要组织培养技术(5学时) 教学目的与要求 掌握植物组织培养的主要技术,特别是茎尖脱毒原理,花药培养获得单倍体以及幼胚培 养技术的应用。 第一节、植物脱毒及快速繁殖技术 概念与意义 意义:能够有效地保持优良品种的特性; 生产无病毒种苗,防止品种退化 快速繁殖新品种,使优良品种迅速应用: 节约耕地,提高农产品的商品率; 便于运输。 目前受病毒危害严重影响生产的有: 大田作物:马铃薯、甘薯、甘蔗、烟草 蔬菜:白菜、大蒜、葱、番茄、萝卜。 果树:柑橘、苹果、草莓、香蕉。 ●花卉:香石竹、各种菊花、天竹葵、紫罗兰等 块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物,每年相当一部分产品要用留作种。如 大蒜:留种量占产量的五到八分之 马铃薯:留种量占产量的十分之 贝母:留种量占产量的三分之 、植物的脱毒技术 1.基本原理 病毒在植物体内的分布具有不均匀性 理论假说: (1)、能量竞争病毒核酸和植物细胞分裂时DNA合成均需要消耗大量的能量,而分生 组织细胞本身很活跃,其DNA合成是自我提供能量自我复制,而病毒核酸的合成要靠植物 提供能量来自我复制,因而就得不到足够的能量,从而就抑制了病毒核酸的复制。 (2)、传导抑制病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的,但在分生组织中, 维管组织还不健全,从而抑制了病毒向分生组织的传导 (3)、激素抑制在分生组织中,生长素和细胞分裂素水平均很高,因而阻滞了病毒的 侵入或者抑制病毒的合成 (4)、酶缺乏1969年, Stace- Smith提出,可能病毒的合成需要的酶系统在分生组织中 缺乏或还没建立,因而病毒无法在分生组织中复制。 (5)、抑制因子1976年, Martin- Tanguy等提出了抑制因子假说,认为在分生组织中存
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第四章) 主讲教师：柳俊博士、教授 第四章 植物主要组织培养技术（5 学时） 教学目的与要求： 掌握植物组织培养的主要技术，特别是茎尖脱毒原理，花药培养获得单倍体以及幼胚培 养技术的应用。 第一节、植物脱毒及快速繁殖技术 一、 概念与意义 意义：能够有效地保持优良品种的特性； 生产无病毒种苗，防止品种退化； 快速繁殖新品种，使优良品种迅速应用； 节约耕地，提高农产品的商品率； 便于运输。 目前受病毒危害严重影响生产的有： 大田作物：马铃薯、甘薯、甘蔗、烟草。 蔬 菜：白菜、大蒜、葱、番茄、萝卜。 果 树：柑橘、苹果、草莓、香蕉。 花 卉：香石竹、各种菊花、天竹葵、紫罗兰等 块根、块茎、鳞茎为繁殖器官的作物，每年相当一部分产品要用留作种。如： 大 蒜：留种量占产量的五到八分之一。 马铃薯：留种量占产量的十分之一。 贝 母：留种量占产量的三分之一。 二、植物的脱毒技术 1．基本原理 病毒在植物体内的分布具有不均匀性 理论假说： (1)、能量竞争 病毒核酸和植物细胞分裂时 DNA 合成均需要消耗大量的能量，而分生 组织细胞本身很活跃，其 DNA 合成是自我提供能量自我复制，而病毒核酸的合成要靠植物 提供能量来自我复制，因而就得不到足够的能量，从而就抑制了病毒核酸的复制。 (2)、传导抑制 病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的，但在分生组织中， 维管组织还不健全，从而抑制了病毒向分生组织的传导。 (3)、激素抑制 在分生组织中，生长素和细胞分裂素水平均很高，因而阻滞了病毒的 侵入或者抑制病毒的合成。 (4)、酶缺乏 1969 年，Stace-Smith 提出，可能病毒的合成需要的酶系统在分生组织中 缺乏或还没建立，因而病毒无法在分生组织中复制。 (5)、抑制因子 1976 年，Martin-Tanguy等提出了抑制因子假说，认为在分生组织中存
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第四章) 主讲教师:柳俊博士、教授 在有某种抑制因子。 茎尖脱毒是控制植物病毒的有效途径 (1)、药物防治病毒病效率低, (2)、抗病毒育种步履艰难 (3)、组织培养的高效隔离防治了病毒的再侵染 2.植物脱毒的技术规程 母体植株的选择和预处理 母体的选择:欲脱毒材料的品种典型性;外植体健康程度选择。 预处理 B C 热处理区 度 生长区 无损伤 脱毒区 热致死区 香石竹在38~40°C条件下经两个月处理可除去全部病毒 菊花在35~38°C的条件下处理60天可使病毒失活。 马铃薯在3τ°C条件下处理10~20天能除去卷叶病毒。 ●柑橘一速衰病毒、黄化病毒需在40°C/30°C条件下处理7~12周。 鳞皮病毒需要在40°C/30°C条件下处理8周 啐叶病毒需要在50°C条件下处理3~22小时。 亚洲青果病毒在50°C条件下处理30~40分钟。 实茎尖分生组织培养再生植株 茎尖分生组织培养有两个概念: shoot tip- shoot apex apical meristem-apical dome
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第四章) 主讲教师：柳俊博士、教授 在有某种抑制因子。 茎尖脱毒是控制植物病毒的有效途径 (1)、药物防治病毒病效率低， (2)、抗病毒育种步履艰难 (3)、组织培养的高效隔离防治了病毒的再侵染 2．植物脱毒的技术规程 * 母体植株的选择和预处理 母体的选择：欲脱毒材料的品种典型性；外植体健康程度选择。 预处理： A B C 无损伤 脱毒区 热致死区 香石竹在 38～40°C 条件下经两个月处理可除去全部病毒。 菊花在 35～38°C 的条件下处理 60 天可使病毒失活。 马铃薯在 37°C 条件下处理 10～20 天能除去卷叶病毒。 柑橘－速衰病毒、黄化病毒需在 40°C/30°C 条件下处理 7～12 周。 鳞皮病毒需要在 40°C/30°C 条件下处理 8 周。 啐叶病毒需要在 50°C 条件下处理 3～22 小时。 亚洲青果病毒在 50°C 条件下处理 30～40 分钟。 * 茎尖分生组织培养再生植株 茎尖分生组织培养有两个概念：shoot tip－shoot apex； apical meristem－apical dome. 生长区 生 热处理区 长 温 度 高 温
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第四章) 主讲教师:柳俊博士、教授 ☆脱毒效果检测 指示植物鉴定( test plants)所谓指示植物是指具有能够辨别某种病毒的专化性症状的 寄主植物。 血清鉴定( serologic test)试管沉淀反应;免疫双扩散;酶联免疫吸附测定( ELISA) *脱毒苗的保存与繁殖 脱毒苗的离体保存与繁殖 建立脱毒种苗生产繁殖网络体系 木本植物建立隔离的脱毒苗母本园 3.影响脱毒效果的因素 母体材料病毒侵染的程度 *起始培养的茎尖大小 离体茎尖大小的马铃薯脱毒效果的影响 茎尖长(mm)叶原基数小植株数脱毒植株数脱毒率(%) 50 24 48 0.27 42 18 42.9 *外植体的生理状态 、离体无性繁殖( propagation in vitro) 离体繁殖的一般技术 无菌培养物的建立 培养物的增殖:腋芽増殖:不定芽増殖;胚状体増殖;愈伤组织増殖 生根培养 生产用苗的培植 离体繁殖的使用范围 用于加速某些难繁殖或繁殖速度很低的植物,或某些需要需要加速繁殖的特殊基因 型,如名贵花卉、优良资源、果树芽变分离、工程植株等等 ●用于自然繁殖极易感染病毒的植物,如马铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉、石竹、百合等 用于有性繁殖变异范围过大而自然条件下又不易无性繁殖的植物,如非洲菊、花 竹、紫罗兰等
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第四章) 主讲教师：柳俊博士、教授 * 脱毒效果检测 指示植物鉴定(test plants) 所谓指示植物是指具有能够辨别某种病毒的专化性症状的 寄主植物。 血清鉴定(serologic test) 试管沉淀反应；免疫双扩散；酶联免疫吸附测定(ELISA)。 * 脱毒苗的保存与繁殖 脱毒苗的离体保存与繁殖 建立脱毒种苗生产繁殖网络体系 木本植物建立隔离的脱毒苗母本园 3．影响脱毒效果的因素 * 母体材料病毒侵染的程度 * 起始培养的茎尖大小 离体茎尖大小的马铃薯脱毒效果的影响 茎尖长(mm) 叶原基数 小植株数 脱毒植株数 脱毒率（％） 0.12 1 50 24 48 0.27 2 42 18 42.9 0.6 4 64 0 0 * 外植体的生理状态 三、离体无性繁殖(propagation in vitro) 1．离体繁殖的一般技术 无菌培养物的建立 培养物的增殖: 腋芽增殖；不定芽增殖；胚状体增殖; 愈伤组织增殖 生根培养 生产用苗的培植 2．离体繁殖的使用范围 用于加速某些难繁殖或繁殖速度很低的植物，或某些需要需要加速繁殖的特殊基因 型，如名贵花卉、优良资源、果树芽变分离、工程植株等等。 用于自然繁殖极易感染病毒的植物，如马铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉、石竹、百合等 等。 用于有性繁殖变异范围过大而自然条件下又不易无性繁殖的植物，如非洲菊、花 竹、紫罗兰等
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第四章) 主讲教师:柳俊博士、教授 3.离体繁殖的有关问题: 外源生长调节剂对品种典型性的影响 继代次数与变异 增殖方式的合理选择 第二节、花药及花粉培养 概念及意义 1.概念 花药培养其外植体是植物雄性生殖器官的一部分,就培养方法和技术来讲,属于器官 培养的范畴 花粉培养的精确定义是:将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来,再加以离体培 养。有时花粉培养也称为小孢子培养( microspore culture)。从培养方法和技术方面来讲,它 属于细胞培养的范畴 2.单倍体植物的特点 所谓单倍体 haploid)是指具有配子体染色体数的孢子体(植物个体) diploid植物其 haploid即为 monoploid 玉米2n=2x=20n=x=10 水稻2n=2x=24n=x=12 柑橘2n=2x=18n=x=9 tetraploid植物其 haploid为 dihaploid 马铃薯2n=4x=48n=2x=24 陆地棉2n=4x=52n=2x=26 hexaploid植物其 haploid为 triploid 普通小麦2n=6x=42n=3x=21 octoploid植物其 haploid为 tetraploid 草莓2n=8x=56n=4x=28 单倍体植物与它们的二倍体相比较,有三个明显的特点: 体细胞染色体数减半 生长发育弱,体形小、各器官明显减小 雌雄配子严重败育,有的甚至不能进入有性世代 3.单倍体的应用潜力 ●迅速获得纯合型材料,缩短育种年限
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第四章) 主讲教师：柳俊博士、教授 3．离体繁殖的有关问题： 外源生长调节剂对品种典型性的影响 继代次数与变异 增殖方式的合理选择 第二节、花药及花粉培养 一、 概念及意义 1．概念 花药培养其外植体是植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技术来讲，属于器官 培养的范畴。 花粉培养的精确定义是：将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来，再加以离体培 养。有时花粉培养也称为小孢子培养(microspore culture)。从培养方法和技术方面来讲，它 属于细胞培养的范畴。 2．单倍体植物的特点 所谓单倍体(haploid)是指具有配子体染色体数的孢子体(植物个体)。 diploid 植物其 haploid 即为 monoploid 玉米 2n = 2x = 20 n = x = 10 水稻 2n = 2x = 24 n = x = 12 柑橘 2n = 2x = 18 n = x = 9 tetraploid 植物其 haploid 为 dihaploid 马铃薯 2n = 4x = 48 n = 2x = 24 陆地棉 2n = 4x = 52 n = 2x = 26 hexaploid 植物其 haploid 为 triploid 普通小麦 2n = 6x = 42 n = 3x = 21 octoploid 植物其 haploid 为 tetraploid 草莓 2n = 8x = 56 n = 4x = 28 单倍体植物与它们的二倍体相比较，有三个明显的特点： 体细胞染色体数减半； 生长发育弱，体形小、各器官明显减小； 雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代。 3．单倍体的应用潜力 迅速获得纯合型材料，缩短育种年限
华中农业大学创建国家精品课程—细胞工程学文本教案(第四章) 主讲教师:柳俊博士、教授 获得育种中间材料 与诱变育种相结合可以提高诱变频率 ●与细胞融合相结合,使这一育种途径更具有实际应用意义 作为遗传工程受体更为有效 用作基础遗传研究的各个领域 Utilization of haploid cell line Haploid cell line Mutation Cel induction and Genetic hybridization selection of cells engineering Regeneration f plants Utilization of new forms in breeding and crop improvement 、花药培养 首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是印度学者Guha和 Maheshwari(1964, 1966}。目前己有250多种植物花药培养成功 目前,花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的 育种中广泛应用。 花药培养的基本程序是 外植体选择一外植体(花蕾)预处理一外植体消毒一剥取花药一接种一诱导培养-分化培 养
华中农业大学创建国家精品课程——细胞工程学 文本教案(第四章) 主讲教师：柳俊博士、教授 获得育种中间材料 与诱变育种相结合可以提高诱变频率 与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义 作为遗传工程受体更为有效 用作基础遗传研究的各个领域 Utilization of haploid cell line 二、花药培养 首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是印度学者 Guha 和 Maheshwari (1964, 1966)。目前已有 250 多种植物花药培养成功。 目前，花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的 育种中广泛应用。 花药培养的基本程序是： 外植体选择－外植体(花蕾)预处理—外植体消毒—剥取花药—接种—诱导培养—分化培 养 Haploid cell line Mutation induction and selection of cells Cell habridization Genetic engineering Regeneration of plants Utilization of new forms in breeding and crop improvement