轻杂重 沉降方向链链链 DNA的组成 I t 亲代DNA (两条重链) 两条轻链) 工 实际结果 分裂一次后 分裂二次后 分裂三次后 88 图113证明DNA半保留复制的 Meselsen -Stah实验图解 实际上,DNA合成的反应是很复杂的,催化这个反应 的酶也有多种,除DNA聚合酶外,还有RNA引物合成酶(即 引发酶)、DNA连接酶、拓扑异构酶、解螺旋酶及多种蛋白 质因子参与。现将与DNA合成有关的几种酶和蛋白质因子 扼要介绍如下; 引物合成酶(亦称引发酶, Primase)
272 图 11-3 证明 DNA 半保留复制的 Meselsen-Stahl实验图解 实际上，DNA 合成的反应是很复杂的，催化这个反应 的酶也有多种，除 DNA 聚合酶外，还有 RNA 引物合成酶(即 引发酶)、DNA 连接酶、拓扑异构酶、解螺旋酶及多种蛋白 质因子参与。现将与 DNA 合成有关的几种酶和蛋白质因子 扼要介绍如下； 1．引物合成酶(亦称引发酶，Primase) 轻杂重 合 沉降方向链链链 亲代DNA （两条重链） 对照DNA （两条轻链） 对照DNA （两条重链和 轻链混合） 实际结果 分裂一次后 的DNA 分裂二次后 的DNA 分裂三次后 的DNA DNA的组成
此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合 成DNA的引物( Primer)。催化引物RNA合成的酶对利福平 ( rifampicin不敏感,而且在一定程度上可用脱氧核糖核苷酸 代替核糖核苷酸作为底物,而与经典的RNA聚合酶不同 大肠杆菌的引物酶为一条单链多肽,分子量为60000。 2.DNA聚合酶( DNA polymerase) 目前已知的DNA聚合酶有多种,它们的性状和在DNA 合成中的功能均不相同。在大肠杆菌中发现有3种DNA聚 合酶,分别称为DNA聚合酶I、Ⅱ、Ⅲ。DNA聚合酶 最初是在1955年由 Kornberg在大肠杆菌内发现的。 Kornberg将其进行了高度纯化。纯化的酶是一条单链多肽, 呈球状,直径约为65nm,是DNA直径的3倍左右。相对 分子质量为109000。每个分子含一个锌原子。这个锌原子 与酶的催化作用有关。DNA聚合酶I是多功能酶 (1)、它具有5′→3′聚合酶功能,形成3′,5′—磷酸 二脂键,DNA聚合酶都不能从无到有开始合成DNA 链,只能在已有引物的3′端游离一OH上合成延伸 DNA,合成延伸方向为5→3′; (2)、5′→3′外切酶作用。 273
273 此酶以 DNA 为模板合成一段 RNA，这段 RNA 作为合 成 DNA 的引物(Primer)。催化引物 RNA 合成的酶对利福平 (rifampicin)不敏感，而且在一定程度上可用脱氧核糖核苷酸 代替核糖核苷酸作为底物，而与经典的 RNA 聚合酶不同。 大肠杆菌的引物酶为一条单链多肽，分子量为 60 000。 2． DNA 聚合酶(DNApolymerase) 目前已知的DNA聚合酶有多种，它们的性状和在DNA 合成中的功能均不相同。在大肠杆菌中发现有 3 种 DNA 聚 合酶，分别称为 DNA 聚合酶 I、Ⅱ、Ⅲ。DNA 聚合酶 I 最初是在 1955 年由 Kornberg 在大肠杆菌内发现的。 Kornberg 将其进行了高度纯化。纯化的酶是一条单链多肽， 呈球状，直径约为 6.5nm，是 DNA 直径的 3 倍左右。相对 分子质量为 109 000。每个分子含一个锌原子。这个锌原子 与酶的催化作用有关。DNA 聚合酶 I 是多功能酶： （1）、它具有 5′→3′聚合酶功能，形成 3′ ，5′—磷酸 二脂键，DNA 聚合酶都不能从无到有开始合成 DNA 链，只能在已有引物的 3′端游离—OH 上合成延伸 DNA，合成延伸方向为 5′→3′ ； （2）、5′→3′外切酶作用
它的主要功能是对DNA损伤的修复 B、以及在DNA复制时,填补RNA引物切除后留下的 空隙 (3)、3′→5′外切酶的活性,在正常聚合条件下此酶活性 很低,一旦出现碱基错配,则聚合反应停止,此酶活 性增强,它被认为具有校对的功能; 当有底物和模板存在时,DNA聚合酶Ⅰ可将脱氧核糖核 苷酸逐个地加到具有3′OH末端的多核苷酸(RNA引物 或DNA)链上形成3′,5′—磷酸二脂键(图114)。至今已 发现的DNA聚合酶都不能从无到有开始合成DNA链,只 能在已有引物的3′端游离一OH上合成延伸DNA,合成 延伸方向为5′→3′。该酶具有3′→5′核酸外切酶的活 性,能在3′—OH端将DNA链水解。在正常聚合条件下, 3′→5′外切酶活性很低。一旦出现碱基错配,则聚合反 应停止,由3′→5′外切酶将错配的核苷酸切除,然后继 续进行正常的聚合反应。3′→5′核酸外切酶被认为具有 校对的功能。5′→3′核酸外切酶的功能是由5′端水解双 链DNA,切下单核苷酸或一段寡核苷酸。它可能起着切 除DNA损伤部分或将5′端RNA引物切除的作用。DNA
274 A、它的主要功能是对 DNA 损伤的修复； B、以及在 DNA 复制时，填补 RNA 引物切除后留下的 空隙； （3）、3′→5′外切酶的活性，在正常聚合条件下此酶活性 很低，一旦出现碱基错配，则聚合反应停止，此酶活 性增强，它被认为具有校对的功能； 当有底物和模板存在时，DNA 聚合酶 I 可将脱氧核糖核 苷酸逐个地加到具有 3′—OH 末端的多核苷酸(RNA 引物 或 DNA)链上形成 3′，5′—磷酸二脂键(图 11-4)。至今已 发现的 DNA 聚合酶都不能从无到有开始合成 DNA 链，只 能在已有引物的 3′端游离—OH 上合成延伸 DNA，合成 延伸方向为 5′→3′。该酶具有 3′→5′核酸外切酶的活 性，能在 3′—OH 端将 DNA 链水解。在正常聚合条件下， 3′→5′外切酶活性很低。一旦出现碱基错配，则聚合反 应停止，由 3′→5′外切酶将错配的核苷酸切除，然后继 续进行正常的聚合反应。3′→5′核酸外切酶被认为具有 校对的功能。5′→3′核酸外切酶的功能是由 5′端水解双 链 DNA，切下单核苷酸或一段寡核苷酸。它可能起着切 除 DNA 损伤部分或将 5′端 RNA 引物切除的作用。DNA
聚合酶Ⅰ在细胞中担负着多种功能,如双链缺口的填补, 单股链的置换合成,具有引物的环形、线形单股链的合成 引物链 碱基 链 图11-4DNA聚合醇催化的DNA链延伸反应 DNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ与聚合酶I的特性和功能有相同之 处,也有区别,如表11-1所示。 DNA聚合酶Ⅱ是由一条相对分子质量为120000的多 肽链组成,它的活力很低,其生理功能尚不清楚。可能在 修复紫外光引起的DNA损伤中起某种作用 DNA聚合酶Ⅲ极为复杂,目前已知它的全酶含有10种 共22个亚基组分和锌原子,其组成是a2e202t2y2826 2x22B4(如表11-2所示)。其中。亚基的分子量为132 000,具有5′→3′DNA聚合酶活性。a、ε和θ三种亚基 组成全酶的核心酶(称为poⅢ。e亚基具有3′外切酶的 校对功能,可以提高DNA复制的保真性。核心酶本身活力 较低,只作用于带缺口的双链DNA,加上τ亚基后成为 聚体,称polⅢ′,polⅢ′就可以利用带有引物的长单链 DNA。Y和δ亚基则与酶功能的持续性有关,它们与6 275
275 聚合酶 I 在细胞中担负着多种功能，如双链缺口的填补， 单股链的置换合成，具有引物的环形、线形单股链的合成。 图 1 1-4 DNA聚合酶催化的DNA链延伸反应 DNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ与聚合酶I的特性和功能有相同之 处，也有区别，如表11-1所示。 DNA聚合酶Ⅱ是由一条相对分子质量为120 000的多 肽链组成，它的活力很低，其生理功能尚不清楚。可能在 修复紫外光引起的DNA损伤中起某种作用。 DNA聚合酶Ⅲ极为复杂，目前已知它的全酶含有10种 共22个亚基组分和锌原子，其组成是α2ε2θ2τ2γ2δ2δ 2′χ2ψ2β4（如表11-2所示）。其中。亚基的分子量为132 000，具有5′→3′DNA聚合酶活性。α、ε和θ三种亚基 组成全酶的核心酶(称为pol Щ)。ε亚基具有3′外切酶的 校对功能，可以提高DNA复制的保真性。核心酶本身活力 较低，只作用于带缺口的双链DNA，加上τ亚基后成为二 聚体，称pol Ⅲ′，pol Ⅲ′就可以利用带有引物的长单链 DNA。γ和δ亚基则与酶功能的持续性有关，它们与δ′、 CH2 H H OH H H H O CH2 H H OH H H H O O P O O O O P O O O P O O 碱基 碱基 O 引物链 模 板 链 CH2 H H O H H H O CH2 H H OH H H H O O O P O 碱基 碱基 O 引物链 模 板 链 PP
x和ψ亚基组装成γ复合体,进一步与核心酶结合,成为 polⅢ*,即“天然的”聚合酶Ⅲ,它与β亚基结合就形成 全酶。在复制起始中β亚基对引物的识别和结合有关, 旦全酶结合到DNA复制的起始部位,β亚基就被释放出来 现在一般认为,DNA聚合酶Ⅲ是原核生物DNA复制的主要 聚合酶。 表11-1大肠杆菌三种DNA聚合酶的性质比较P273 DNA聚合酶IDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ(复合物) 分子结构 单链分子 单链分子 核心酶3个亚基,全酶22 忄个亚基 分子量 109000 120000 400000 每个细胞所含分子数 5’→3’聚合作用 3’→5’核酸外切酶 5’→3’核酸外切酶 模板和引物 完整的双链DNA 具有引物的长单链DNA 全酶+ 具有缺口(<100个核苷 核心酶+ 酸)的双链DNA 聚合速度(87℃核苷酸/100 100-300 15000以上 min.分子) ol C, hol e, dna n, dn 结构基因 pol B X, dna
276 χ和ψ亚基组装成γ复合体，进一步与核心酶结合，成为 pol Ⅲ*，即“天然的”聚合酶Ⅲ，它与β亚基结合就形成 全酶。在复制起始中β亚基对引物的识别和结合有关，一 旦全酶结合到DNA复制的起始部位，β亚基就被释放出来。 现在一般认为，DNA聚合酶Ⅲ是原核生物DNA复制的主要 聚合酶。 表11-1 大肠杆菌三种DNA聚合酶的性质比较P273 DNA 聚合酶 I DNA 聚合酶Ⅱ DNA 聚合酶Ⅲ(复合物) 分子结构 分子量 每个细胞所含分子数 5’ →3’聚合作用 3’→5’核酸外切酶 5’→3’核酸外切酶 模板和引物 完整的双链 DNA 具有引物的长单链 DNA 具有缺口(<100 个核苷 酸)的双链 DNA 聚合速度(37℃核苷酸／ min．分子) 结构基因 单链分子 109 000 400 + + + － + + 1 000 po1 A 单链分子 120 000 100 + + － － － + 100-300 po1 B 核心酶 3 个亚基，全酶 22 个亚基 400 000 10～20 + + － 全酶+ 核心酶+ 15 000 以上 pol C，hol E，dna N，dna X， dna Z，dna Q，ho1 A