(一)柠檬酸积累的调节 1、糖酵解及丙酮酸代谢的调节 (1)磷酸果糖激酶(PFK酶)调节黑曲霉柠檬酸产生菌的PFK酶是酵解途径中 第一个调节酶,也是决定EMP途径代谢流量的最重要的关键酶。此酶受正常的生理浓 度范围的柠檬酸和ATP的抑制,为AMP、Pi、NH所激活,NH还能有效地解除柠 檬酸和ATP对PFK酶的抑制,如表23-15所示。 NH*在细胞内的生理浓度水平下,PK酶对柠檬酸不敏感(见表2316)。考察柠 檬酸发酵时,PFK酶的这些效应物在细胞内的浓度表明,铵离子浓度与柠檬酸生产速 率有密切关系,并且显示在锰缺乏和充足条件下的显著差别,可以认为,锰的效应是通 过铵离子浓度升高而减弱了柠檬酸对PFK酶的抑制。 夜23-16 锰离子充足和锰离子缺乏下具曲零PK活力 柠檬酸/(mmoJ/L) 铵离子/(mmd/L) 活力/u 15 1.1 锰足 3 1,0 (3)丙酮酸羧化酶的调节丙酮酸是真菌糖代谢的一个重要分叉点,丙酮酸既可以 由丙酮酸脱氢酶催化脱羧生成乙酰CoA,也可以由丙酮酸羧化酶催化经CO2固定反应 生成草酰乙酸,CO2固定反应的强度对柠檬酸积累非常重要。保持丙酮酸这两个反应的 平衡是获得柠檬酸高产率的一个重要条件。如上所述黑曲霉柠檬酸产生菌中存在磷酸烯 醇式丙酮酸羧化酶和丙酮酸羧化酶,以丙酮酸羧化酶为主,此酶已被提纯,其酶学性质 已清楚,其活性不受代谢产物的调节。 2、三羧酸循环的调节 (1)柠檬酸合成酶的调节 柠檬酸合成酶是T℃A环中的第一个酶,但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节 作用。 (2)顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节 顺乌头酸水合酶、NAD、NAD异柠檬酸脱氢酶在柠檬酸产生与不产生时,这 种酶均存在,而当铜离子0.3mg,铁离子2mgL和pH2.0情况下,这3种酶均不出 现活力,发酵中柠檬酸正是在这个pH条件下积累的 顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸心顺乌头酸◇异柠檬酸正逆反应的酶,研究表明 黑曲霉中有一种单纯的位于线粒体上的顺乌头酸水合酶,它在催化时能建立下面的平 衡:柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸=90:3:7。并发现在柠檬酸发酵中,无论培养基 中是否存在铁离子,顺乌头酸水合酶催化的反应总是趋向柠檬酸一侧,保证柠檬酸得 到充分积累。一旦柠檬酸积累到一定水平.细胞内的PH下降,就能抑制顺乌头酸水 合酶和异柠檬酸 脱氢酶的活性,就抑制了柠檬酸自身的进一步分解。 黑曲霉中的异柠檬酸脱氢酶有三种:一种NAD异柠檬酸脱氢酶.活力很低。两 种NAD异柠檬酸脱氢酶,其一在细胞质中,不受柠檬酸抑制,其二在线粒体中.与 TCA循环有关,它受生理浓度的柠檬酸抑制,所以当柠檬酸积累到一定水平时,就抑 制此酶的活力,从而更加促进柠檬酸的积累。NAD异柠檬酸脱氢酶的抑制作用在碱性 pH和3 Ommon/L锰离子时被解除,这就是国外菌种柠檬酸积累受锰离子毒害的缘故
（一） 柠檬酸积累的调节 1、 糖酵解及丙酮酸代谢的调节 已清楚，其活性不受代谢产物的调节。 2、 三羧酸循环的调节 （1）柠檬酸合成酶的调节 柠檬酸合成酶是 TCA 环中的第一个酶，但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节 作用。 （2）顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节 顺乌头酸水合酶、NAD、NAD-异柠檬酸脱氢酶在柠檬酸产生与不产生时，这 3 种酶均存在，而当铜离子 0.3mg/L，铁离子 2mg/L 和 pH2.0 情况下，这 3 种酶均不出 现活力，发酵中柠檬酸正是在这个 pH 条件下积累的。 顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸<>顺乌头酸<>异柠檬酸正逆反应的酶，研究表明， 黑曲霉中有一种单纯的位于线粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平 衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸＝90：3：7。并发现在柠檬酸发酵中，无论培养基 中是否存在铁离子，顺乌头酸水合酶催化的反应总是趋向柠檬酸一侧，保证柠檬酸得 到充分积累。一旦柠檬酸积累到一定水平．细胞内的 PH 下降，就能抑制顺乌头酸水 合酶和异柠檬酸 脱氢酶的活性，就抑制了柠檬酸自身的进一步分解。 黑曲霉中的异柠檬酸脱氢酶有三种：一种 NAD 异柠檬酸脱氢酶．活力很低。两 种 NAD 异柠檬酸脱氢酶，其一在细胞质中，不受柠檬酸抑制，其二在线粒体中．与 TCA 循环有关，它受生理浓度的柠檬酸抑制，所以当柠檬酸积累到一定水平时，就抑 制此酶的活力，从而更加促进柠檬酸的积累。NAD 异柠檬酸脱氢酶的抑制作用在碱性 pH 和 30mmol／L 锰离子时被解除，这就是国外菌种柠檬酸积累受锰离子毒害的缘故
(3)a-酮戊二酸脱氢酶酌调节在黑曲霉柠檬酸产生菌中,TCA循环的一个显著 特点是。α-酮戊二酸脱氢酶的合成受高葡萄糖和铵离子的阻遏。因此当以葡萄糖为碳 源时,在柠檬酸生长期,菌体内不存在α-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。α-酮戊二酸 脱氢酶催化的反应是了TCA循环中唯一不可逆反应,一旦α-酮戊二酸脱氢酶丧失 就会引起:⑦TCA循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆T℃A循环生成, 使T℃CA循环成“马蹄形”。②α-酮戊二酸又抑制NM一异柠檬酸脱氢酶的活性 (二)Mn2+调节 比较Mn2丰富和Mn2缺乏的分批培养时发现,当黑曲霉在缺Mn2的产柠橡酸培 养基中,菌体的组成代谢(戊糖磷酸途径,生糖途径)的酶和三羧酸循环的脱氢酶活力 显著降低。不论锰丰富或缺乏,都未检岀α-酮戊二酸脱氢酶。乙醛酸循环的脱氢酶也 几乎无活力。 当缺锰时,HMP和TCA循环水平低,生长期菌丝的蛋白质、核酸和脂肪含量明 减少,而氨基酸和铵离子水平升高,丙酮酸和草酰乙酸水平升高,柠檬酸大量积累。 当黑曲霉生长在缺锰的高浓度糖培养基中,细胞内铵离子异常高,达25mmol/L 随之出现谷氨酸、谷氨酰胺、鸟氨酸、精氨政和γ氨基丁酸的积累和分泌,使铵离 子对细胞毒性被解除。这些氨基酸的积累是由于测报蛋白质合成受到干扰,导致蛋白 质分解增加,细胞内蛋白质和核酸的减少所致。当锰离子充足时,添加环己酰亚胺 可促进铵离子和氨基酸积累,由此可知,铵离子积累是由于蛋白质和RNA转换过程 中细胞蛋白质的再合成受损伤引起的。锰离子是催化核糖核酸形成聚合阶段第一步反 应酶所需的,若猛离于缺乏,核酸、蛋白质合成受阻,而使细胞内的铵离子水平升高。 铵离子水平升高解除了柠檬酸和AIP对PFK酶的抑制.从而增加EM代谢流量,丙 酮酸和草酰乙酸水平升高,而使柠檬酸大量积累,这就是锰离子的调节效应 三)氧对柠檬酸积累的调节 乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一个氧原子,因此氧也可以看 作为柠檬酸生物合成底物。它对柠檬酸发酵的作用为: (1)从图2-3—7可知氧是发酵过程(EMP途径和丙酮酸脱氢)生成的NADH2重新 氧化的氢受体。 〔2〕近来的研究发现,黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链以外,还有一条侧系 吸 链,如图2-3-7所示 SHAM抑制 侧系呼吸链 蛋自 制零家抑制 氰化物抑制 细胞色囊b 细匙色囊c 细胞色a、43 标准呼吸链 图23-7黑曲霉的标准呼吸链和侧系呼吸链 此侧系呼吸链对水杨酸酰异肟酸(SHAM)敏感,在黑曲霉生长期,此侧链不受水 杨酸酰异肟酸的抑制。在柠檬酸发酵产酸期受SHAM的强烈抑制。通过标准呼吸链氧 化时产生ATP,会反馈抑制PFK酶,而通过侧系呼吸链不产生AP,而当缺氧时.只 要很短时间中断供氧,就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活,从而导致柠檬酸产酸急
之一。 (3)α-酮戊二酸脱氢酶酌调节 在黑曲霉柠檬酸产生菌中，TCA 循环的一个显著 特点是。α-酮戊二酸脱氢酶的合成受高葡萄糖和铵离子的阻遏。因此当以葡萄糖为碳 源时，在柠檬酸生长期，菌体内不存在α-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。α-酮戊二酸 脱氢酶催化的反应是了 TCA 循环中唯一不可逆反应，一旦α-酮戊二酸脱氢酶丧失， 就会引起：⑦TCA 循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆 TCA 循环生成， 使 TCA 循环成“马蹄形”。②α-酮戊二酸又抑制 NM—异柠檬酸脱氢酶的活性。 （二） Mn2+调节 比较 Mn2+丰富和 Mn2+缺乏的分批培养时发现，当黑曲霉在缺 Mn2+的产柠橡酸培 养基中，菌体的组成代谢(戊糖磷酸途径，生糖途径)的酶和三羧酸循环的脱氢酶活力 显著降低。不论锰丰富或缺乏，都未检出 α-酮戊二酸脱氢酶。乙醛酸循环的脱氢酶也 几乎无活力。 当缺锰时，HMP 和 TCA 循环水平低，生长期菌丝的蛋白质、核酸和脂肪含量明 显减少，而氨基酸和铵离子水平升高，丙酮酸和草酰乙酸水平升高，柠檬酸大量积累。 当黑曲霉生长在缺锰的高浓度糖培养基中，细胞内铵离子异常高，达 25mmol／L， 随之出现谷氨酸、谷氨酰胺、鸟氨酸、精氨政和 γ—氨基丁酸的积累和分泌，使铵离 子对细胞毒性被解除。这些氨基酸的积累是由于测报蛋白质合成受到干扰，导致蛋白 质分解增加，细胞内蛋白质和核酸的减少所致。当锰离子充足时，添加环己酰亚胺， 可促进铵离子和氨基酸积累，由此可知，铵离子积累是由于蛋白质和 RNA 转换过程 中细胞蛋白质的再合成受损伤引起的。锰离子是催化核糖核酸形成聚合阶段第一步反 应酶所需的，若猛离于缺乏，核酸、蛋白质合成受阻，而使细胞内的铵离子水平升高。 铵离子水平升高解除了柠檬酸和 ATP 对 PFK 酶的抑制．从而增加 EMP 代谢流量，丙 酮酸和草酰乙酸水平升高，而使柠檬酸大量积累，这就是锰离子的调节效应。 （三） 氧对柠檬酸积累的调节 乙酰 CoA 和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一个氧原子，因此氧也可以看 作为柠檬酸生物合成底物。它对柠檬酸发酵的作用为： (1)从图 2—3—7 可知氧是发酵过程(EMP 途径和丙酮酸脱氢)生成的 NADH2 重新 氧化的氢受体。 〔2〕近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系 呼吸 链，如图 2—3—7 所示。 此侧系呼吸链对水杨酸酰异肟酸(SHAM)敏感，在黑曲霉生长期，此侧链不受水 杨酸酰异肟酸的抑制。在柠檬酸发酵产酸期受 SHAM 的强烈抑制。通过标准呼吸链氧 化时产生 ATP，会反馈抑制 PFK 酶，而通过侧系呼吸链不产生 ATP，而当缺氧时．只 要很短时间中断供氧，就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活，从而导致柠檬酸产酸急
剧下降。一旦恢复供氧,标准呼吸链复活,而不影响菌的生长;但侧系呼吸链却不能 恢复,故对产酸速率有很大影响。所以柠檬酸发酵过程中,特别是产酸期,一定要充 足氧的供给,以保证更多的NHDH通过侧系呼吸链将H2交给O2生成CO2和H20, 使呼吸产生的ATP减少,解除ATP对PK酶的反馈抑制。使EMP代谢流增大,丙酮 酸和草配乙酸生成水平提高,柠檬酸产率提高。 黑曲霉柠檬酸发酵机制 (1)由于严格限制供给话离子等金属离子,或筛选耐高浓度锰离于、锌离子、 铁离子等金属离子的菌株,降低菌体中糖代谢转向合成蛋白质、脂肪酸、核酸的能力 使细胞中形成高水平的铵离子,从而解除柠檬酸和AP对PFK酶的反馈抑制,使EMP 途径的代谢流增大 (2)存在一条呼吸活动性强的侧系呼吸链,对氧敏感,但不产生AP,这样使 细胞内的ATP浓度下降。因而减轻了ATP对PK酶、CS酶的反馈抑制,促进了EMP 途径的畅通,增加柠檬酸的生物合成: (3)丙酮酸羧化酶是组成性酶,不受代谢调节控制,可源源不断地提供草酰乙 酸,丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2固定反应取平衡,保证前体物乙酰CoA和 草酰乙酸的提供,柠檬酸合成酶又基本上不受调节或极微弱,增强了柠檬酸的合成能 (4)α-酮戊二酸脱氢酶是受葡萄糖和铵离子的阻遏.使黑曲霉中的TA循环 变成“马蹄形”的代谢方式,减弱TA循环,降低细跑内AP浓度,另外使,a-酮 戊二酸浓度升高。反过来.又反馈抑制异柠檬政脱氢酶,降低柠檬酸的自身分解; (5)顺乌头酸水合酶催化时建立柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸=90:3:7的 平衡,顺乌头酸水合酶的作用总是趋向于合成柠檬酸,即柠檬政分解活力低。一旦柠 檬酸浓度升高到某一水平,就抑制异柠檬酸脱氢酶活力,从而进一步促进柠檬酸自身 积累,pH降至2.o以下。顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活,更有利于柠檬酸 积累并排出体外。 第三节柠檬酸发酵生产菌种 黑曲霉(Asp,nger) 黑曲霉柠檬酸的形态特征 (1)在米曲汁或麦芽汁培养基上菌丝白色,不是绒球状,凸起,边缘整齐,菌 落较小,带皱折。在麦芽汁培养基上生长4d成熟的孢子呈黑褐色。 (2)在察氏培养基上生长较慢,菌落边缘整齐,分生孢子梗短,分生孢子着生 较密。 (3)菌丝顶端着生稀疏的大型的黑褐色孢子德,成熟后呈开花状而崩裂 (4)孢子柄(14-15)(1.5-2)以。 (5)顶囊球形d直径为50-72um (6)小梗分二层,初生小梗和次生小梗区别明显,初生小梗(30~31)×7pm, 次生小便大多是3根,也有2根的,大小为(9~13)μm×3.8um。 (⑦分生孢子串珠状着生,黑褐色,表面组糙且有明显的刺状突起,4.7 5.2μm,成熟后遇振动易散落。 、生活周期 黑曲霉属半知菌纲,一般只进行无性繁殖,由孢子发芽开始到新孢子形成 成熟,为一个生活周期。图2-3-1所示是黑曲霉发芽和抱子形成过程 孢子在液体培养基中培养6—鼬开始萌发出芽,长出多根芽,逐渐形成菌丝
剧下降。一旦恢复供氧，标准呼吸链复活，而不影响菌的生长；但侧系呼吸链却不能 恢复，故对产酸速率有很大影响。所以柠檬酸发酵过程中，特别是产酸期，一定要充 足氧的供给，以保证更多的 NHDH2 通过侧系呼吸链将 H2 交给 O2 生成 CO2 和 H20， 使呼吸产生的 ATP 减少，解除 ATP 对 PFK 酶的反馈抑制。使 EMP 代谢流增大，丙酮 酸和草配乙酸生成水平提高，柠檬酸产率提高。 三、黑曲霉柠檬酸发酵机制 (1)由于严格限制供给话离子等金属离子，或筛选耐高浓度锰离于、锌离子、 铁离子等金属离子的菌株，降低菌体中糖代谢转向合成蛋白质、脂肪酸、核酸的能力， 使细胞中形成高水平的铵离子，从而解除柠檬酸和 ATP 对 PFK 酶的反馈抑制，使 EMP 途径的代谢流增大； (2)存在一条呼吸活动性强的侧系呼吸链，对氧敏感，但不产生 ATP，这样使 细胞内的 ATP 浓度下降。因而减轻了 ATP 对 PFK 酶、CS 酶的反馈抑制，促进了 EMP 途径的畅通，增加柠檬酸的生物合成； (3)丙酮酸羧化酶是组成性酶，不受代谢调节控制，可源源不断地提供草酰乙 酸，丙酮酸氧化脱羧生成乙酰 CoA 和 CO2 固定反应取平衡，保证前体物乙酰 CoA 和 草酰乙酸的提供，柠檬酸合成酶又基本上不受调节或极微弱，增强了柠檬酸的合成能 力； (4)α-酮戊二酸脱氢酶是受葡萄糖和铵离子的阻遏．使黑曲霉中的 TcA 循环 变成“马蹄形”的代谢方式，减弱 TcA 循环，降低细跑内 ATP 浓度，另外使，α-酮 戊二酸浓度升高。反过来．又反馈抑制异柠檬政脱氢酶，降低柠檬酸的自身分解； (5)顺乌头酸水合酶催化时建立柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸＝90：3：7 的 平衡，顺乌头酸水合酶的作用总是趋向于合成柠檬酸，即柠檬政分解活力低。一旦柠 檬酸浓度升高到某一水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶活力，从而进一步促进柠檬酸自身 积累，pH 降至 2．o 以下。顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸 积累并排出体外。 第三节 柠檬酸发酵生产菌种 黑曲霉（Asp.niger） 一、黑曲霉柠檬酸的形态特征 (1)在米曲汁或麦芽汁培养基上菌丝白色，不是绒球状，凸起．边缘整齐，菌 落较小，带皱折。在麦芽汁培养基上生长 4d 成熟的孢子呈黑褐色。 (2)在察氏培养基上生长较慢，菌落边缘整齐，分生孢子梗短，分生孢子着生 较密。 (3)菌丝顶端着生稀疏的大型的黑褐色孢子德，成熟后呈开花状而崩裂。 (4)孢子柄(14—15)μ (1．5—2)μ。 (5)顶囊 球形 d 直径为 50 一 72μm。 (6)小梗 分二层，初生小梗和次生小梗区别明显，初生小梗(30～31 )×7μm， 次生小便大多是 3 根，也有 2 根的，大小为(9～13)µm ×3．8µm。 (7)分生孢子 串珠状着生，黑褐色，表面组糙且有明显的刺状突起，4．7— 5．2µm，成熟后遇振动易散落。 二、生活周期 黑曲霉属半知菌纲，一般只进行无性繁殖，由孢子发芽开始到新孢子形成、 成熟，为一个生活周期。图 2—3-1 所示是黑曲霉发芽和抱子形成过程。 孢子在液体培养基中培养 6—8h 开始萌发出芽，长出多根芽，逐渐形成菌丝
菌丝不久即出现分枝。黑曲霉菌丝是多细胞结构,有横隔,其中可育细胞称为足 细胞。由足细胞长出分生孢子梗,分生孢子梗顶端泡囊的聚集并与原生质膜的融 合,使顶端膨大形成顶囊,上面退生二层小梗,小梗上长出成链的孢子。这样一 个生活周期约50h,但黑曲霉菌丝是不断地生长延长的,孢子也逐渐不断地产生 直至营养枯竭为止。 5 图2-31黑曲霉生活周期 、培养基
菌丝不久即出现分枝。黑曲霉菌丝是多细胞结构，有横隔，其中可育细胞称为足 细胞。由足细胞长出分生孢子梗，分生孢子梗顶端泡囊的聚集并与原生质膜的融 合，使顶端膨大形成顶囊，上面退生二层小梗，小梗上长出成链的孢子。这样一 个生活周期约 50h，但黑曲霉菌丝是不断地生长延长的，孢子也逐渐不断地产生， 直至营养枯竭为止。 三、培养基