课程名称：微生物学 班级：生物工程1101 (第二十三讲) 章节标题：第三节基因重组和杂交育种 第四节基因工程 目的要求：1.了解原核生物基因重组的特点和类型 2.了解真核生物基因重组的特点 3.掌握基因工程的概念 教学重点：1.真核、原核生物基因重组的特点和类型 2.基因工程的概念 教学难点：真核、原核生物基因重组的特点和类型 教学方法：多媒体讲授及讨论法 内容提要及课时分配： 1.原核生物基因重组的特点和类型 35分钟 2.真核生物基因重组的特点 35分钟 3.基因工程的概念 25分钟 4.小结 5分钟 主讲教师：赵萌萌 授课日期：2013年5月14日 兰州交通大学化学与生物工程学院
第三节基因重组和杂交育种 基因重组：两个独立的基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起， 形成新的稳定基因组的过程，叫做基因重组。 自然养的微生物可通过多种途径进行基因重组，并通过基因的重新组合以适 应随时改变的环境以求生存，这种重组不仅发生在不同的微生物细胞之间，而且 也发生在微生物与高等动、植物之间，例如：最近发现的引起人体结核病的结核 分枝杆菌基因组上有8个人的基因，获得这些基因可以使该菌抓抗人体的免疫防 御系统，而得以生存。因此基因的重组是普遍存在的，是生物进化的重要动力之 一。我们也可以利用基因重组的方式进行体外和体内的杂交育种，己获得性状令 我们更加满意的菌种。 、原核生物的基因重组 原核生物的基因重组通常只是部分遗传物质的转移与重组，有片断性、单向 性和转移机制多样等特点。方式主要有转化、转导、接合及原生质体融合。 (一)转化 1928年，Griffith发现肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的转化 现象，目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力。 定义 转化：受体菌直接吸收来自供体菌的DM片断，通过交换将其整合到自己的 基因组中，从而获得供体菌部分遗传性状的现象叫转化。 转化子：经转化后出现了供体遗传性状的受体细胞，既转化成功的菌株称为 转化子。 转化因子：转化现象是由转化因子引起的，转化因子指有转化活性的外源 DNA片断。它是供体菌释放或人工提取的游离DNA片断。转化因子须具备两个条 件，较高的相对分子质量和同源性。一般以双链较多，单链少见。供体菌和受体 菌亲缘关系越近，DA的纯度越高，越易转化。 感受态：受体菌需要处于感受态才具转化能力。感受态是指细菌能从周围环 境中吸收外源DNA片断并实现转化的生理状态。它可以通过感受态因子与细胞表 面受体相互作用后形成，也可由生长条件诱导形成。一般出现在细菌对数生长的 中、后期。主要有受体菌的遗传性所决定，因此并非所有细胞都能转化。另外还
与细菌的菌龄与培养条件有关 关于细菌转化的感受态有两种学说：一种局部原生质化假说，认为细胞壁能 阻碍转化因子进入受体菌，在某种条件下，细菌局部失去细胞壁，转化因子就能 通过细胞膜进入受体菌。另一种酶受体学说，认为感受态细胞的表面出现一种能 结合DNA并能使之进入细胞的麝， 感受态细胞除了摄取线状染色体DNA以外，也能吸收质粒DNA和噬菌体DNA, 这叫做转染。 以上的这种转化是自然转化，自然转化现象我们说了首先是在肺炎链球菌中 发现的(1928年，见第一节)，70多年米已经发现许多细菌属中的某些种或某些 株有自然转化的能力。近十多年来的研究已表明，通过自然转化进行的基因转移 过程已不只是一种“实验室现象”，而是广泛存在于自然界，可能是自然界进行 基因交换的重要逸径。环境中（士壤、水体、沙粒等）是否能发生自然转化，主要 取决于环境中是否存在具有转化活性的DNA分子及可吸收DA的感受态细胞。研 究表明，几乎所有的生活细菌都可向环境中主动分泌或细胞死亡裂解而释放 NA,这些DNA分子可与固型物（土粒、沙粒子）结合而得到保护，免受DNase的 降解，从而能长时间存留于环境中并具有转化活性，另一方面，自然感受态作为 许多细菌应付不利生活条件的一种调节机制，在自然环境中的存在具有普遍性， 有实验表明，在有些环境中感受态细胞在其群落中的比例可高达16%。 那么从自然转化中我们得到了启发，为什么不能利用细菌的这种性质为我们 人类所利用呢，我们也可以将我们需要的某种性状，通过将控制这种性状的基因 转化到受体细胞中，使这种对我们有利的性状在供体菌种得以表达。当然这一切 就要在实验室中进行。 人工转化 这是在实验室中用多种不同的技术完成的转化，包括用CC12处理细胞，电 穿孔等。为许多不具有自然转化能力的细菌（如大肠杆菌）提供了一条获取外源 DA的途径，也是基因工程的基础技术之一。 1970年由Mandel和Higa首先发现可以用高浓度的Ca2+诱导细胞使其成为 能摄取外源D小A的感受态状态，30年来这种方法已广泛用于以大肠杆菌为受体 的重组质粒的转化（见第十章），但根据有关实验表明，线状的细菌DNA片段却难
以转化，其原因可能是线状DA在进入细胞溶质之前被细胞周质内的DNA酶消化， 缺乏这种DNA酶的大肠杆菌株能高效地转化外源线型DNA片段的事实证实了这 点。有关C2+诱导的机制目前还不十分清楚，一般认为可能与增加细胞的通透 性有关。 电穿孔法(electroporation)对真核生物和原核生物均适用。现在已用这种 技术对许多不能导入A的G和G+细菌成功的实现了转化。所谓电穿孔法是用 高压脉冲电流击破细胞膜或击成小孔，使各种大分子（包括DA)能通过这些小孔 进入细胞，所以又称电转化，该方法最初用于将NA导入真核细胞，后来也逐渐 用于转化包括大肠杆菌在内的原核细胞。在大肠杆菌中，通过优化各个参数（电 场强度、电泳冲长度和DNA浓度等)，每微克DNM可以得到109-10转化体。但由 于C2+诱导法简便，价廉，因此仍为实验室中大肠杆菌转化的常用方法。 (二)转导 1952年，辛德和莱德伯格在实验鼠伤寒沙门氏杆菊能否进行接合作用时发 现了转导。 1.定义 转导：通过缺陷型噬菌体将供体菌的D小A片断携带到受体菌中，使后者获得 前者部分遗传性状的现象。 转导子：通过转导获得供体细胞部分遗传性状的重组受体细胞成为转导子。 转导可分为普遍性转导和局限性转导二种类型。在普遍性转导中，噬菌体可 以携带供体菌上的任何一段基因将它转导至受体细胞中：而在局限性转导中，噬 菌体总是携带少数同样的片段到受体细胞中。 2.普遍转导 噬菌体侵入寄主细胞后，通过复制和合成，将寄主DA降解成很多小片断， 进入装配阶段。正常情况下，噬菌体将自身的A包裹在衣壳中，但也有异常的 可能，它误将寄主细胞的D八A的某一片断包裹进去，这样的噬菌体叫缺陷噬菌体 体内仅含有供体DNA的缺陷噬菌体叫做完全缺陷噬菌体，同时含有两种DNA的叫 部分缺陷噬菌体。这种异常情况出现的几率是很低的，但由于噬菌体产生的子代 数量很多，所以这种情况还是时常出现的。当包裹有寄主D八A片断的噬菌体释放 后再度感染新的寄主，其中供体菌的DA片断进入受体菌，并通过基因重组使受
体菌形成稳定地转导子。 普遍性转导可出现两种情况： (1)完全普遍转导 进入受体菌的供体菌DA片断与受体菌染色体同源区段配对，通过双交换整 合在染色体上，随者受体菌的分裂，每个子细胞都含有这个片断。 (2)流产普遍转导 进入受体菌的供体菌D八A片断不与受体染色体整合，也不能复制，仅能转录 而得到表达。细胞分裂后两个子细胞中只有一个细胞能得到来自供体菌的DA 片断，另一个子细胞只获得供体菌基因的产物酶，可在表型上出现供体菌的特 征，但随着细胞分裂次数的增多，该酶越来越少，最终又成受体菌原来的状态。 3.局限转导 指通过某些部分缺陷的温和噬菌体将供体菌的少数特定基因携带至受体菌 的转导。被转导的特定基因共价的与噬南体DA连接，与噬菌体DNA一起复制、 切割、包装、感染受体细胞后，整合进宿主染色体形成稳定的转导子。 它只能转导一种后少数几种基因，一般为整合位点两侧的基因。如入噬菌体 侵入大肠杆菌KI2菌株后，其DA整合在细菌D八M的与合成生物素和发酵半乳糖 有关的基因间，使寄主细胞溶原化。如果该溶原性细菌因诱导发生裂解时，释放 的噬菌体大多数是正常的，极少数由于不正常的切割带有合成生物素或发酵半乳 糖的基因，而将磁菌体的DA中的一段留在寄主细胞上。带有以上两种基因的部 分缺陷噬菌体再侵染缺乏这两种基因的受体菌，就是原来不能合成生物素或不发 酵半乳糖的细菌，具有合成生物素的能力或发酵半乳糖的遗传性状。 根据转导子出现频率的高低，局限转导可分为两类： (1)低频转导 入噬菌体，就是一种低频转导。这种只能产生极少数的部分缺陷噬菌体，用 它感染的宿主细胞也只有极少数能成为转导子，大部分都还是正常的。 (2)高频转导 当一种被称为双重溶原菌（同时感染有正常噬菌体和缺陷噬菌体的细菌）被 诱导时，就会产生含有等量的正常噬菌体和缺陷噬菌体，这时用这种裂解物去感 染受体菌，那么在受体菌中会有50%成为转导子，这种转导叫高频转导