医学者佛学实业于用 实验一人类体细胞染色体标本制备与核型分析 Metaphase Chromosome Preparation and Analysis of Karyotype 【实验日的】 1.然悉人类外周血淋巴细胞的培养方法及染色体标本的制备方法 2,然悉人类染色体G显带标本制备与分析。 【实验原理】 染色体是在显微镜下可见细胞有丝分裂过程中出规的结构。因此，必须 获得染色体标本才能进行检查分析，通常情况下，都是利用外周血淋巴细胞 过行核型分析。正常情况下，人体外周血淋巴细匙不再分裂，但拉物血凝素 《)可莉激血中的淋巴细咆转化成淋巴母细电，使其恢复抛殖能力.囚此， 可采取少量外周静欧血，散短期培养，培养至72小时细胞进入增殖正弦期， 此时加入秋水仙素抑制知胞分裂，使细胞分经停止在中期以获得足够量的分 裂期细胞，经低渗、固定、制片、染色后镜下观察进行核型分析。上述制备 的染色体标本经被蛋白箭消化、Ciensa染色后，可在染色体纵轴上显示出者 色深、浅相间的横纹一一带，表明每条染色体的特征。 【实验用品】 1,采血器材、酒辖灯、培养瓶、超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、高 心机、刻度离心管、乳头吸管、试管架，量简、试剂瓶，载破片、欧风 机、托盘天平、显微镜、镜油、二甲茶、擦镜纸、摄子、烧杯、记号笔、 玻片架、火柴、10l注射器， 2.WI1640茂体培养基，小牛血清、肝素(500U/al)、枝物血凝煮(Pm)、 秋水仙素(10mg/l)、C1低渗液(0.075l/L.、甲醇、冰乙酸、Giemsa 乐液、磷酸缓冲液(6.8). 3.2.5%胰酶溶液(anks液配荆)、0.4%盼红、Gins染色液、1N盐酸、 IN氢氧化钠， 【实验步骤】 中国医科大学医学过传学数乐室
医学遗传学实验手册 1 中国医科大学医学遗传学教研室 实验一 人类体细胞染色体标本制备与核型分析 Metaphase Chromosome Preparation and Analysis of Karyotype 【实验目的】 1．熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法及染色体标本的制备方法。 2．熟悉人类染色体 G 显带标本制备与分析。 【实验原理】 染色体是在显微镜下可见细胞有丝分裂过程中出现的结构。因此，必须 获得染色体标本才能进行检查分析，通常情况下，都是利用外周血淋巴细胞 进行核型分析。正常情况下，人体外周血淋巴细胞不再分裂，但植物血凝素 （PHA）可刺激血中的淋巴细胞转化成淋巴母细胞，使其恢复增殖能力。因此， 可采取少量外周静脉血，做短期培养，培养至 72 小时细胞进入增殖旺盛期， 此时加入秋水仙素抑制细胞分裂，使细胞分裂停止在中期以获得足够量的分 裂期细胞，经低渗、固定、制片、染色后镜下观察进行核型分析。上述制备 的染色体标本经胰蛋白酶消化、Giemsa 染色后，可在染色体纵轴上显示出着 色深、浅相间的横纹——带，表明每条染色体的特征。 【实验用品】 1．采血器材、酒精灯、培养瓶、超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、离 心机、刻度离心管、乳头吸管、试管架、量筒、试剂瓶、载玻片、吹风 机、托盘天平、显微镜、镜油、二甲苯、擦镜纸、镊子、烧杯、记号笔、 玻片架、火柴、10ml 注射器。 2．RPMI 1640 液体培养基、小牛血清、肝素（500 U/ml）、植物血凝素（PHA）、 秋水仙素（10mg/ml）、KCl 低渗液（0.075mol/L）、甲醇、冰乙酸、Giemsa 原液、磷酸缓冲液（PH6.8）。 3．2.5％胰酶溶液（Hanks 液配制）、0.4％酚红、Giemsa 染色液、1N 盐酸、 1N 氢氧化钠。 【实验步骤】
医子透传学实验于用 一，外周血淋巴细胞染色体标本制备与分析 1.采血及接种培养 1.1在酒精灯火馅上，用灭菌注射器（一次性注射器）抽取肝素0.2m1, 使肝素湿润至管壁。 1.2常规消毒后，采集外周静脉血5m1,转动注射器使血液与肝煮混匀 1.3在超净工作台中，预先将PWI1640液体培养基(51，含植物血凝 煮60mg/ml、10%小牛血清)加入消毒好的小培养瓶中，再滴加25滴 全血(6号针头)，水平摇动混匀。 1.4置37℃伍温培养箱中培养72小时。培养过程中每天水平摇动培养 物1一2次，使血液均匀悬浮，再继续培养。 1.5终止培养前2一4小时，加入秋水仙素，使终浓度达到0.2μg/m1。 轻轻摇动培养瓶，使秋水仙素混匀。继续培养至72小时。 2.制片 21收集细胞时，去掉瓶塞，用乳头吸管吸取培养液，充分混匀培养物， 再将全部培养物吸入刻度离心管中。 2.21000rpm离心8分钟（注意先配平）. 2.3弃上清液，加入37℃预温的0.075o1/LKC1溶液8m1,用吸管 轻轻吹打细胞团混匀后，置37℃恒温水浴箱低渗处理25分钟。 2.4加入1ml新配制的固定剂（甲醇：冰乙酸=3：1），用吸管小心吹打、 混匀，1000rpm离心8分钟. 2.5弃上清液，加入8ml固定剂，吹打细胞团制成细胞悬液后，室温下 固定20分钟。 2.61000rpm离心8分钟。 2.7弃上清液，重复固定一次。 28弃上清液，根据细跑数量的多少适当加入数漓新配制的固定剂，吹 打细胞制成悬液， 2.9吸取少量细胞悬液，滴2一3滴于冰水浸泡过的载玻片上，吹散，气 干。 2.10将标本置Giemsa染液中，染色8分钟，水洗去浮色，气干. 2.11显微镜下观察染色体标本分裂相的多少及分散情况。 二，人外周血淋巴细胞染色体G显带标本制备与分析 中国医科大学医学道传学教研室
医学遗传学实验手册 2 中国医科大学医学遗传学教研室 一．外周血淋巴细胞染色体标本制备与分析 1. 采血及接种培养 1.1 在酒精灯火焰上，用灭菌注射器（一次性注射器）抽取肝素 0.2ml， 使肝素湿润至管壁。 1.2 常规消毒后，采集外周静脉血 5ml，转动注射器使血液与肝素混匀。 1.3 在超净工作台中，预先将 RPMI 1640 液体培养基（5ml，含植物血凝 素 60mg/ml、10%小牛血清）加入消毒好的小培养瓶中，再滴加 25 滴 全血（6 号针头），水平摇动混匀。 1.4 置 37℃恒温培养箱中培养 72 小时。培养过程中每天水平摇动培养 物 1～2 次，使血液均匀悬浮，再继续培养。 1.5 终止培养前 2～4 小时，加入秋水仙素，使终浓度达到 0.2μg/ml。 轻轻摇动培养瓶，使秋水仙素混匀。继续培养至 72 小时。 2．制片 2.1 收集细胞时，去掉瓶塞，用乳头吸管吸取培养液，充分混匀培养物， 再将全部培养物吸入刻度离心管中。 2.2 1000 rpm 离心 8 分钟（注意先配平）。 2.3 弃上清液，加入 37℃预温的 0.075 mol/L KCl 溶液 8 ml，用吸管 轻轻吹打细胞团混匀后，置 37℃恒温水浴箱低渗处理 25 分钟。 2.4 加入 1ml 新配制的固定剂（甲醇：冰乙酸=3：1），用吸管小心吹打、 混匀，1000rpm 离心 8 分钟。 2.5 弃上清液，加入 8ml 固定剂，吹打细胞团制成细胞悬液后，室温下 固定 20 分钟。 2.6 1000 rpm 离心 8 分钟。 2.7 弃上清液，重复固定一次。 2.8 弃上清液，根据细胞数量的多少适当加入数滴新配制的固定剂，吹 打细胞制成悬液。 2.9 吸取少量细胞悬液，滴 2～3 滴于冰水浸泡过的载玻片上，吹散，气 干。 2.10 将标本置 Giemsa 染液中，染色 8 分钟，水洗去浮色，气干。 2.11 显微镜下观察染色体标本分裂相的多少及分散情况。 二．人外周血淋巴细胞染色体 G 显带标本制备与分析
医学遗传学实验于两 1.G显带染色体标本制各 1.1常规制片后，将标本置70℃烤箱中干烤2小时，自然冷却。 1.2取2.5%胰醇溶液5m1,加入染色缸中，加入45m1生弹盐水，用1W HC1或1 N NaOH及酚红旧节胰藓溶液成紫红色(PH6.8~7,2),置37℃ 预温。 1.3将玻片标木放入胰溶液中处理25一45秒钟，不新轻轻粗动玻片， 使璃酶作用均匀。随者处理标本数量增加，钠醇逐渐消耗，胰酶作 用时间逐渐延长。 1.4取出染色体玻片标本，置于37℃预温的生理盐水中，然后用蒸馏水 冲洗玻片（或轻甩，除去多余的秋融） 1.5将玻片标本放入37℃预温的Giem5n染液中，染色5-10分钟。 1.6自米水冲洗，气干 1,7显微镜观察。 【实验结果与分析】 ·,常规染色体核型分析 1,根据染色体的形态、大小及着丝粒的位置，将染色体分为七组。 A组染色体：包括1一3号染色体。长度量长，1号和3号染色体为中 央着丝粒，2号染色体为亚中央着丝粒染色体。 B组染色体：包括4一5号染色体，长度次于A组：亚中央着丝粒染色 体，短臂较短。 C组染色体：包括6一12号和X染色体，中等长度，亚中央若丝粒染 色体。 D组染色体：包括13一15号染色体，具有近端着粒和随体： E组染色体：包括16一18号染色体，16号染色体着丝粒在3/8处， 17号和18号染色体着丝粒约在1/4处. F组染色体：包括19号和20号染色体，中央着丝粒 G组染色体：包括21号、22号和Y染色体，是染色体组中最小的， 为近端着丝粒的染色体。21号和22号染色体具有随体。 2.绘图：绘出在显微镜下观察到的染色体， 中因医料大学医学遭传学教研室
医学遗传学实验手册 3 中国医科大学医学遗传学教研室 1. G 显带染色体标本制备 1.1 常规制片后，将标本置 70℃烤箱中干烤 2 小时，自然冷却。 1.2 取 2.5％胰酶溶液 5ml，加入染色缸中，加入 45 ml 生理盐水，用 1N HCl 或 1N NaOH 及酚红调节胰酶溶液成紫红色（PH6.8～7.2），置 37O C 预温。 1.3 将玻片标本放入胰酶溶液中处理 25～45 秒钟，不断轻轻摇动玻片， 使胰酶作用均匀。随着处理标本数量增加，胰酶逐渐消耗，胰酶作 用时间逐渐延长。 1.4 取出染色体玻片标本，置于 37℃预温的生理盐水中，然后用蒸馏水 冲洗玻片（或轻甩，除去多余的胰酶）。 1.5 将玻片标本放入 37℃预温的 Giemsa 染液中，染色 5～10 分钟。 1.6 自来水冲洗，气干。 1.7 显微镜观察。 【实验结果与分析】 一. 常规染色体核型分析 1．根据染色体的形态、大小及着丝粒的位置，将染色体分为七组。 A 组染色体：包括 1～3 号染色体。长度最长，1 号和 3 号染色体为中 央着丝粒，2 号染色体为亚中央着丝粒染色体。 B 组染色体：包括 4～5 号染色体，长度次于 A 组；亚中央着丝粒染色 体，短臂较短。 C 组染色体：包括 6～12 号和 X 染色体，中等长度，亚中央着丝粒染 色体。 D 组染色体：包括 13～15 号染色体，具有近端着丝粒和随体。 E 组染色体：包括 16～18 号染色体，16 号染色体着丝粒在 3/8 处， 17 号和 18 号染色体着丝粒约在 1/4 处。 F 组染色体：包括 19 号和 20 号染色体，中央着丝粒。 G 组染色体：包括 21 号、22 号和 Y 染色体，是染色体组中最小的， 为近端着丝粒的染色体。21 号和 22 号染色体具有随体。 2．绘图：绘出在显微镜下观察到的染色体
医学边传学实验于帮 》 1 3 5 >>I A II IIi 8 10 11 12 41100 I II 33 13 14 15 16 17 18 1483 0000 19 20 21 22 二.G显带染色体标本分析 G带显示的正常人显带核型特征（见附阁1.1、1.2、1.3） A组染色体：包括1一3号染色体。长度最长，1号和3号染色体为中央 着丝粒，2号染色体为亚中央着丝粒染色体 1号染色体 短臂：在320条带左右的分裂相上，近侧段有两条深带，第2条深带 稍宽；在处星好的标本上，远侧段可显出34条浅染的深带。此臂分为 3个区，近侧的第1深带为2区1带，第2深带为3区1带， 长臂：副经痕紧贴着丝粒，染色深浅不·，其远侧为一宽的浅带，近 4 中国医科大学医学通传学教研室
医学遗传学实验手册 4 中国医科大学医学遗传学教研室 二．G 显带染色体标本分析 G 带显示的正常人显带核型特征（见附图 1.1、1.2、1.3） A 组染色体：包括 1～3 号染色体。长度最长，1 号和 3 号染色体为中央 着丝粒，2 号染色体为亚中央着丝粒染色体。 1 号染色体 短臂：在 320 条带左右的分裂相上，近侧段有两条深带，第 2 条深带 稍宽；在处理好的标本上，远侧段可显出 34 条浅染的深带。此臂分为 3 个区，近侧的第 1 深带为 2 区 1 带，第 2 深带为 3 区 1 带。 长臂：副缢痕紧贴着丝粒，染色深浅不一，其远侧为一宽的浅带，近
医平遗传学实验于用 中段与远侧段各有两条深带，中段两条深带稍靠近，其中第2条染色 较浓。此臂分为四个区，副缢痕远侧的浅带为2区1带，中段第2深 带为3区1带，远侧段第1深带为4区1带。 2号染色体 短臂可见四条深带，中段的两条深带较靠近。光臂分为2个区，中段 两条深带之间的浅带为2区1带。 长臂：有7条深带，第3和第4深带有时融合。此臂分为3个区，第 2和第3深带之间的浅带为2区1带，第4和第5深带之间的浅带为3 区1带。 3号染色体 着丝粒区浓染 短臂：在近侧段可见一条较宽的深带，远侧段可见两条深，其中远 侧的一条较窄，且若色较浅，这是区别3号染色体短臂的重要特征。 近侧段的深带可分为两条深带。此臀分2个区，中段浅带为2区1带： 长臂：一般在近侧和远侧段各有一条较宽的深带。在显带好的标本上， 近侧段的深带可分为两条深带，远侧段的深带可分为三条深带。比臂 分为2个区，中段浅带为2区1带。 B组染色体：包括4一5号染色体，长度次于A组：亚中央若丝粒染色体， 短情较短. 4号染色体 短臂：可见两条深带，近侧深带染色较浅，短臂只有一个区 长臂：可见均匀分布的四条深带，在显带较好的标本上，远侧段的两 条深带可各自再分为两条较宽的深带。此臂分为3个区，近侧段第1 和第2深带之间的浅带为2区1带，远侧段的两条深带之间的浅带为3 区1带， 5号染色体 短臂：可见两条深带。其中远侧的深带宽而且色浓，短臂只有一个区。 长臂：近湖段有两条深带，染色较浅，有时不明悬：中段可见三条深带， 染色较深，有时融合成一条宽的深带：远侧段可见二条深带，近末端的 一条着色较浓。此臂可分为3个区，中段第2深带为2区1带，中段 深带与远侧段深带之间的宽阔的浅带为3区1带： 中国医科大学医学进传学教研室
医学遗传学实验手册 5 中国医科大学医学遗传学教研室 中段与远侧段各有两条深带，中段两条深带稍靠近，其中第 2 条染色 较浓。此臂分为四个区，副缢痕远侧的浅带为 2 区 1 带，中段第 2 深 带为 3 区 1 带，远侧段第 1 深带为 4 区 1 带。 2 号染色体 短臂可见四条深带，中段的两条深带较靠近。此臂分为 2 个区，中段 两条深带之间的浅带为 2 区 1 带。 长臂：有 7 条深带，第 3 和第 4 深带有时融合。此臂分为 3 个区．第 2 和第 3 深带之间的浅带为 2 区 1 带，第 4 和第 5 深带之间的浅带为 3 区 1 带。 3 号染色体 着丝粒区浓染 短臂：在近侧段可见一条较宽的深带，远侧段可见两条深带，其中远 侧的一条较窄，且着色较浅，这是区别 3 号染色体短臂的重要特征。 近侧段的深带可分为两条深带。此臂分 2 个区，中段浅带为 2 区 1 带。 长臂：一般在近侧和远侧段各有一条较宽的深带。在显带好的标本上， 近侧段的深带可分为两条深带，远侧段的深带可分为三条深带。此臂 分为 2 个区，中段浅带为 2 区 1 带。 B 组染色体：包括 4～5 号染色体，长度次于 A 组；亚中央着丝粒染色体， 短臂较短。 4 号染色体 短臂：可见两条深带，近侧深带染色较浅，短臂只有一个区。 长臂：可见均匀分布的四条深带，在显带较好的标本上，远侧段的两 条深带可各自再分为两条较宽的深带。此臂分为 3 个区，近侧段第 1 和第 2 深带之间的浅带为 2 区 1 带，远侧段的两条深带之间的浅带为 3 区 1 带。 5 号染色体 短臂：可见两条深带，其中远侧的深带宽而且色浓，短臂只有一个区。 长臂：近侧段有两条深带，染色较浅，有时不明显；中段可见三条深带， 染色较深，有时融合成一条宽的深带；远侧段可见二条深带，近末端的 一条着色较浓。此臂可分为 3 个区，中段第 2 深带为 2 区 1 带，中段 深带与远侧段深带之间的宽阔的浅带为 3 区 1 带