不完全,过稀则溶剂用量太大,影响操作。一般萃取3~4次即可完成,每 次所用溶剂与水溶液应保持一定的比例,第一次提取时,溶剂要多一些, 般为水提取液的1/3~1/2为宜,以后的用量可以少一些,一般为1/6~1/4 即可。 3.逆流连续萃取法 逆流连续萃取法是一种连续的两相溶剂萃取法。有一根、数根或更多 的萃取管构成装置。臂内用小瓷圈或小的不锈钢丝圈填充,以增邡两相溶 剂萃取时的接触面。例如用氯仿从川楝树皮的水浸液中萃取川楝素。将氯 仿装于萃取管内,而密度小于氯仿的水提取浓缩液贮于高位容器内,开启 活塞,则水提液在高位压力下流人萃取管,遇瓷圈撞击而分散成细粒,使 与氯仿接触面增大,萃取就比较完全。如果是用苯、乙酸乙酯等比水轻的 溶剂进行举取,则需将水提液装在萃取管内,而苯、乙酸乙酯贮于高位容 器内。检杳萃取是否完全,可取样品用薄层层析、纸层析及显色反应或沉 淀反应进行。 4逆流分配法 逆流分配法( counter current distribution,CCD)与两相溶剂逆流苯取 法原理相似,是一种加样量一定,在一定容量的两相溶剂中,经多次移位萃 取分配而使混合物分离的分离方法。溶剂选择的原则是对混合物分离效果较 好,即分配系数差异大的两种不相混溶的溶剂。本法所采用的逆流分布仪是 由若干只管子组成。若无此仪器,小量萃取时可用分液漏斗代替。逆流分配 法对于分离具有非常相似性质的混合物,往往可以取得良好的效果。但操作 时间长,萃取管易因机被振荡而损坏,消耗溶剂较多,应用上常受到一定 限制 5,液滴逆流层析 液滴逆流层析是近年来在逆流层析法基础上改进的两相溶剂萃取法。对 溶剂系统的选择基本同逆流层析法,但要求能在短时间内分离成两相,并可 生成有效的液滴。由于移动相形成液滴,在细的分配萃取管中与固定相有效 地接触、摩擦,不断形成新的表面,促进溶质在两相溶剂中的分配,故其分 离效果往往比逆流层析法好。且不会产生乳化现象,用氮气压驱动移动相, 被分离物质不会因遇大气中氧气而氧化。本法必须选用能生成液滴的溶剂系 统,处理样品量较小,一般在1g以下,并要求一定设备,但对高分子化合 物的分离效果较差。液滴逆流分配法的操作较繁琐,所以应用较少。目前, 对适用于逆流分配法进行分离的成分,可采用两相溶剂逆流连续萃取装置或 分配柱层析法替代。 4 中药有效成分提取分离技术
、沉淀法 沉淀法是在中草药提取液中加入某些试剂使其析出其中某种或某些成 分,或析出其杂质,产生沉淀,以获得有效成分或除去杂质的方法,包括醇 沉法、酸碱沉淀法、铅盐沉淀法等。 1.醇沉法 中荜药的水提液中常含有树胶、黏液质、蛋白质、淀粉等,可以加入 定量的乙醇,使这些不溶于乙醇的成分从溶液中沉淀析出,而达到与其他成 分分离的目的。例如自中草药提取液中除去这些杂质,或从白及水提液中获 得白及胶,都是采用乙醇沉淀法。丙酮在蛋白质、多糖的提取中也常做沉淀 试剂,如自新鲜栝楼根汁中制取天花粉蛋白,可滴入丙酮使分次沉淀析出 另外,提取多糖及多肽类化合物,也多采用水溶解、浓缩、加乙醇或丙酮析 出的办法。 实例1栝楼中天花粉蛋白的分离 取新鲜栝楼根刨太表皮,压汁,汁液放置过夜后离心,上清液加等量乙 醇有沉淀析出,离心除去,母液再加0.5倍量乙醇,离心收集此部分沉淀, 仍含杂质。再于此母液中加1倍量的乙醇,则析出较纯的蛋白质沉淀,蛋白 质用水溶解,冷冻干燥,即为天花粉蛋白纯品2 2.酸碱沉淀法 酸碱沉淀法是利用某些成分能在酸或碱液中溶解,当加碱或加酸调整溶 液的pH后,所需成分又恢复回原来结构,成不溶物而析出以达到分离的目 的(具体操作见前面溶剂分离法)。 实例2蝙蝠葛中提取蝙蝠葛碱 取蝙蝠葛粗粉,以0.5%的硫酸水溶液温热浸提2次,合并提取液,用 浓氨水碱化至pH9.0~9.5,然后用苯萃取,合并苯液,再以2%的盐酸萃 取苯溶液,合并酸水萃取液,用氨水调pH为9,产生沉淀,过滤,水洗至 中性,60℃下烘干,即得蝙蝠葛碱成品121 3.铅盐沉淀法 铅盐沉淀法是分离某些中草药成分的经典方法之一。由于屮性醋酸铅或 碱式醋酸铅在水及醇溶液中,能与多种中草药成分生成难溶的铅盐或络合物 沉淀,故可利用这种性质使有效成分与杂质分离。中性醋酸铅能与酸性成分 或某些酚类物质结合成不溶性铅盐。因此,常用于沉淀有机酸、氨基酸、蛋 白质、黏液质、鞣质、树脂、酸性皂苷、部分黄酮等。碱式醋酸铅产生不溶 性铅盐或络合物的范围更广。通常将中草药的水或醇提液先加入醋酸铅浓溶 15 中药有效成分的分离纯化方法
液,静置后滤出沉淀。然后将铅盐沉淀悬浮于新溶剂中,通以硫化氛气体, 使铅转为不溶性硫化铅而沉淀除去。硫化氢脱铅比较彻底,但溶液中多余的 硫化氦,必须通入空气或二氧化碳让气泡带出,以免在处理溶液时参与化学 反应。新牛态的硫化铅多为胶体沉淀,能吸附药液中的有效成分,要注意用 溶剂处理收回。另外,也可用硫酸、磷酸、硫酸钠、磷酸钠等方法除铅,但 不如硫化氢除铅彻底。阳离子交换树脂也可以用来脱铅,快而彻底,但药液 屮某些有效成分也可能被交换上去,造成吸附损失 实例3槲树皮中槲皮苷的提取 槲树( Qucercus dentata thunb.)皮的乙醇提取液,先加人少量中性醋 酸铅溶液,搅拌均匀,析出暗棕色沉淀,滤除沉淀(含大量杂质和少量槲皮 苷),于滤液中继续加入中性醋酸铅溶液至不再产生橙黄色沉淀。过滤收集 沉淀,洗净后,悬浮于乙醇中,通入硫化氡至铅盐全部分解,过滤,蒸干滤 液,得黄色残渣,溶于热水中,滤除不溶物,放冷,槲皮苷即结晶析出可 除上述沉淀方法外,蛋白质还可以等电点沉淀析出,如某些蛋白质溶 液,可以变更溶液的pH,利用其在等电点时溶解度最小的性质而使之沉淀 析出。此外,还可以用明胶、蛋白溶液沉淀鞣质;胆甾醇也常用以沉淀洋地 黄皂苷等。沉淀试剂可根据中草药有效成分和杂质的性质,适当选用 作为种初步的纯化方法,沉淀法也经常被用在皂苷的研究中,将含有 皂昔的提取物(如经丁醇水分配之后)的浓缩的甲醇溶液倒入大量的乙醚 中,利用过滤或离心的方法收集沉淀的皂苷,反复利用这种方法,可以得到 很好的分离效果( Hostettmann和 Marston,1995)。 四、盐析法 盐析法是在中草药的水提液中加人无机盐使之达到一定的浓度或半饱和 或饱和状态后,可使提取液中的某些成分在水中的溶解度降低而沉淀析出 从而达到与水溶性大的杂质分开的一种分离方法。一般的生物碱、皂苷、挥 发油等都可用盐析从水溶液中分离出来。常用作盐析的无机盐有氯化钠、氯 化钾、氯化钙、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵、碳酸钾等。例如在:七的水提取 液中加硫酸镁至饱和状态,三七皂苷乙即可沉淀析出;从大麦中提取淀粉酶 也是加入硫酸铵盐析;从黄藤中提取掌叶防已碱,三颗针中提取小檗碱都可 用氯化钠或硫酸铵盐析制备;有些水溶性较大的成分如原白头翁素、麻黄 碱、苦参碱等,在提取时,亦往往先在水提取液中加入一定量的氯化钠,再 用有机溶剂萃取。 实例4大友中提取淀粉酶 16 中药有效成分提取分离技术
大麦( Hordeum vulgare)种子25~27℃发芽7d,麦芽搞碎,压汁, 在汁液中加入硫酸铵盐析,沉淀物冷冻干燥,磨粉,即为淀粉酶 五、透析法 透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜,而大分子物质不能通 过半透膜的性质来达到分离的一种纯化方法。在分离纯化蛋白质、多肽、多 糖、皂昔等分子质量较大的物质时,常采用本法除杂,以除去无机盐、单 糖、双糖等杂质。反之如果杂质是大分子的蛋白质、淀粉、树脂等,也可用 此法将其留在半透膜内,而将小分子的所要成分通过半透膜进人膜外溶液 中,而加以分离精制。透析膜有多种规格, 透析是否成功与透析膜的规格关系极大, 需要根据欲分离成分的具体情况而选择 透析膜有动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜 (硫酸纸膜)、蛋白质胶膜、玻璃纸膜等 实验室操作常用市售的玻璃纸或动物性半 透析膜 透膜扎成袋状,外面用尼龙网袋加以保护, 小心加入欲透析的样品溶液,悬挂在清水 容器中。透析过程中需要经常更换清水 使透析膜内外溶液的浓度差加大,以加快 图2-1透析法示意 透析速度,必要时还可以适当加热,并加 以搅拌。为了加快透析速度,还可采用电透析法,即在半透膜旁边纯溶剂两 端放置二个电极,接通电路,带电荷的离子的透析速度可增加10倍以上。 判断透析是否完全,可取透析膜内溶液进行定性反应检查。透析法如图21 所示。 六、结晶法 般地说,中草药的化学成分在常温下多半是固体物质,常具有结晶的 通性,因此,可以根据溶解度的不同,用结晶法来达到分离、纯化、精制的 目的。结晶法在中草药成分分离的后期是实验室常用的纯化方法。但是,并 非由第一章所述方法提取得到的所有的提取液都可以直接用结晶法分离、纯 化,过多杂质的存在会十扰结晶的形成,有时少量的杂质也会阻碍晶体的析 出。因此,结晶前应该先尽可能地除去杂质 1.除去十扰结晶的杂质 中草药经过溶剂提取和初步分离后所得到的成分,大多仍是混合的组 7 中药有效成分的分离纯化方法
分。混合物中的杂质,有时即使是少量或微量杂质存在,也能阻碍或延缓结 晶的形成。所以在制备结品时,必须尽可能除去杂质,避免对结晶的干扰。 除去杂质的方法很多,可采用前面提到的溶剂法,可选用溶剂溶出杂质,或 只溶出所需要的成分;有时可用少量活性炭等进行脱色处理,以除去有色杂 质;沉淀法、透析法、超滤法等也是常用的去除杂质的方法;还可采用后面 要提到的层析法,层析法是分离制备单体纯品常用的有效方法,可将粗提物 通过装有氧化铝、硅胶、大孔吸附树脂等的柱子层析后,再进行结晶。选择 柱层析用填料时,应根据所要成分的性质,注意使其不被吸附而损失。 如果经反复处理仍不能使近于纯品的成分结晶化,则可先将其制备成结 品态的衍生物,再纯化还原后,可望得到结晶。例如游离生物碱常可先制备 成生物碱盐类,羟基化合物可先转变成乙酰化物,羰基化合物可先制备成苯 腙衍生物结晶。美登碱就是反复分离精制仍难以得到结晶,但如果先制备成 3-溴丙基美登碱结晶后,再经水解除去溴丙基,美登碱就能制备成为结晶 2.结晶溶剂的选择 合适的溶剂是结晶的关键。所谓适宜的结晶溶剂,最好是在冷时对所要 的成分溶解度较小,而热时溶解度又较大的溶剂。溶剂的沸点亦不宜太高。 一般常用甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙酯等。 制备结晶溶液也常釆用混合溶剂。--般是先将化合物溶于易溶的溶剂 中,再在室温下滴加适量的难溶的溶剂,直至溶液微呈浑浊,并将此溶液微 微加温,使溶液完全澄清后放置。如虎杖苷重结晶时,可先溶于水,制成饱 和水溶液,再加一层乙醚放置,即可促使虎杖苷的结晶 但也有些化合物的结晶需要特殊的溶剂,在一般溶剂中却不易形成结 晶。例如葛根素、逆没食子酸( ellagic acid)在冰醋酸中易形成结晶,大黄 素( emodin)在吡啶中易于结品 3.结晶的操作 结晶是把含有固体溶质的饱和溶液加热蒸发溶剂或降低温度后,使原来 溶解的溶质成为有一定几何形状的固体(晶体)析出的过程,析出晶体后的 溶液仍是饱和溶液,又称母液。因此,结晶的方法通常有两种。 (1)蒸发溶剂法也叫浓缩结晶法。对于溶解度受温度变化影响不大的 固体溶质适用。将溶液加热蒸发(或慢慢挥发),过饱和的溶质就能成固体 析出。 2)冷却热的饱和溶液法也叫降温结晶法。适用于溶解度受温度变化 影响较大的固体溶质的结品。先用适量的溶剂在加温的情况下,将化合物溶 解制成过饱和的溶液,然后再放置冷处,通常放于冰箱中让其溶质从溶液中 18 中药有效成分提取分离技术