析出 结晶过程中,一般是溶液的浓度越高,降温越快,析出结晶的速度乜就 越快。但是得到的结晶质量也就差些,颗粒往往较小,杂质也可能多些。有 时结品从溶液中析出的速度太快,超过化合物品核的形成和分子定向排列的 速度,往往只能得到无定形粉末。结晶溶液的浓度也要适中。有时溶液太 浓,黏度太大,反而不易结晶化。如果溶液浓度适当,温度慢慢降低,则有 可能析出晶形较大、纯度较高的结晶 不同化合物结晶所需的时间也不同。有的化合物结晶速度较快,有的化 合物结晶的形成则需要较长的时间,例如铃兰毒苷等,有时需放置数天或更 长的时间,如果放置一段时间后没有结品析出,常用加入极微量的晶种,即 同种化合物结品的微小颗粒,来诱导晶核的形成。没有晶种时,可用玻璃棒 蘸过饱和结晶溶液一滴,在空气中挥发掉溶剂,再用玻璃棒来摩擦容器内壁 溶液边缘处,以诱导结晶的形成。如仍无结晶析出,可打开瓶塞任溶液逐渐 挥发,慢慢析晶。如果仍无结晶析出,则可能需要另选适当溶剂处理。或是 因为纯度不够,难以结晶,需再精制一·次,尽可能除尽杂质后进行结晶 操作。 如果在室温中可以析出结品,就最好不要放置于冰箱中操作,因为低温 下结晶往往容易析出更多的杂质。 4.重结晶及分步结晶 第一次结晶得到品态物质往往不是很纯,可以用溶剂溶解再次结晶精 制,这个过程叫重结晶,这种方法称为重结晶法。在制备结晶时,通常在 形成一批结晶后,立即吸出上层的母液于十净的容器中,母液放置后可以 得到第二批结晶,如此下去可以得到各级的结晶。另外,结晶经重结后 所得的母液,也通常再经上述处理乂可分别得到笫二批、第三批结晶。这 种方法则称为分步结品法或分级结晶法。在分级结晶过程中,结晶的析出 速度总是越来越快,纯度也是越来越高。所以分步结晶法各部分所得结 晶,其纯度往往有较大的差异,在检查前最好不要贸然混在一起,以免纯 度又下降 重结晶和分步结晶法不仅可以纯化同一成分,还可分离得到不同的成 分。如从蛇床子巾提取蛇床子素( osthole)和欧前胡蕠( Imperatorin)。 实例5结晶法纯化甘草甜素 首先将甘草切细加5倍量的冷水浸泡2d,浸提液过滤分别得到滤液和 滤渣,往滤渣中再加人3倍量的冷水浸泡12h,再次过滤得到滤液。合并两 次滤液蒸发浓缩,冷却后加入乙醇并在低温下放置2d,将混合液过滤,滤 19 中药有效成分的分离纯化方法
液再次蒸发浓缩得到黑褐色黏稠状抽提液,此时抽提液中的甘草甜素含量约 为15%,十燥失重在35%以下。甘草抽提液再次浓缩干燥后生成甘草甜素 粗结晶,最后将此粗结晶在稀乙醇溶液中进行重结晶即可得到精制的甘草甜 素产品 实例6分步结晶法提取蛇床子素和欧前胡素 蛇床子粗粉1kg,用5倍量乙醇浸泡3次,合并滤液,减压浓缩至少 量,分为油层(深绿色)和水层(浅黄色),油层用石油醚萃取后放置,析 出大量结晶,粗结晶反复用乙醇重结晶,得到7g白色块晶——蛇床子素 母液放置凝固后,以少量乙醇加热溶解,放置后析出大量粗晶,用无水乙醇 反复重结晶,得到5g浅黄色块晶一·欧前胡素 5.结晶纯度的判定 (1)根据物理性质判断结晶纯度的初步鉴定往往根据化合物的物理性 质。结晶都有一定的结品形状、色泽、熔点和熔距,这是非结品物质所没有 的物埋性质。实验室最常用的依据是熔距,一般纯单体化合物结晶的熔距较 窄,要求在0.5℃左右,如果熔距较长则表示化合物不纯。另外,在判断的 过程中也不要被结晶的形状、熔点所迷惑,化合物结晶的形状和熔点往往因 所用溶剂不同而有差异。如原托品碱在氯仿屮形成棱柱状结晶,熔点 207℃;在丙酮中则形成半球状结晶,熔点203℃;在氯仿和内酮混合溶剂 中则形成以上两种晶形的结晶。这样的情况普遍存在,所以文献中常在化合 物的晶形、熔点之后注明所用溶剂。 根据熔距来判断纯度也有些例外情况,如有些化合物的分解点不易看得 清楚;也有一些立体异构休和结构非常类似的混合物,由于化合物熔点 致,熔距较窄,但不是单体;还有些化合物具有双熔点的特性,即在某一温 度已经全部熔融,当温度继续上升时又固化,再升温至一定温度又熔化或分 解。如防己诺林生物碱在176℃时熔化,至200℃时又固化,当温度升到 242℃时又分解。这些情况皆会影响到结晶纯度的判断 有标准品的化合物,也通常将结晶和标准品混合来测定熔点,如果混合 熔点不下降,即可判断是单体化合物 (2)薄层鉴定法也是实验室常用的鉴定纯度的简易方法。通常是在薄 层层析或纸层层析上采用两种以上的不同展开剂系统和不同的昆色剂来检 定,总为一个斑点者,…般可以认为是一个单体化合物。但应注意,有的化 合物在一般层析条件下,虽然只呈现一个斑点,但并不…一定是单体成分。因 此,应该冏时结合熔距等其他依据一起判断 除此之外,高压液相色谱、气相色谱、紫外光谱等方法,均有助于检识 20 中药有效成分提取分离技术
结品样品的纯度。核磁共振谱,尤其HNMR也是判断结晶纯度的重要 信息。 七、色谱法 色谱法也称层析法,是一种物理分离方法,近年来在实验室和生产中被 广泛应用于中草药有效成分和有效部位的分离、纯化和制备上,是分离、纯 化和鉴定有机化合物的重要方法之一,将在第二章重点介绍。 第二节分离纯化发展中的新技术 、超滤技术 超滤技术是膜提取分离技术的一种,是根据分子量的差异,选择-定截 留分子量的膜除去杂质,富集有效部位或有效成分的分离方法。自20世纪90 年代以来以其高效、节能和绿色等特点,在中药提取分离中的应用越来越多。 超滤技术能耗低,分离效率高,可用于热敏性物质分离,主要用于:注射液 冂服液的澄清,不同分子量的截留,有效成分的分离纯化等方面。注射液如 生脉散、伸筋草、枳实、补骨脂、丹参等;口服液如人参精、生脉饮、海龙 蛤蚧精、四逆汤等;有效成分如绞股蓝总苷、黄芩苷等(详见第四章)。 二、吸附技术 吸附技术是利用特殊的吸附剂大孔吸附树脂的吸附性和分子筛相结 合的原理,从中药提取液中有选择性地吸附其中的有效成分,富集有效成 分、去除杂质的一种分离技术。本法在中药复方有效部位的提取新工艺上得 到了广泛的试用,适合于已知、末知成分的植物性中药复方有效部位的分 离,效率高,提取率2%~5%,产品不吸潮,T艺简单、成本低。此分离 技术对于富集中药中的黄酮类、生物碱类、苷类等有效成分也是卓有成效的 (详见第四章)。 中药有效成分的分离纯化方法
三、澄清技术 我囡中药制药工业对中药提取液的澄清,经典的方法是醇沉法。但已有 不少报道认为将乙醇作为澄清剂有诸多不合理性,如把不溶于醇的无机物成 分作为杂质除去是不妥的,许多现代研究表明具有生物活性与免疫作用的蛋 白质、多糖也极易被醇沉淀除去。另外,醇沉工艺时间长、成本高、损耗乙 醇量般在30%以上,成品中残存的乙醇也可能对药效有所影响。近年来, 一些新材料、新技术开始应用于中药药液的澄清,不仅可降低成本、缩短生 产周期,也能保证制剂稳定性及有效成分的含量。如101果汁澄清剂、甲壳 素、ZTC天然澄清剂等在药液澄清方面的应用,很大程度上解决了经典醇 沉法引起的诸多问题。101果汁澄清剂是水溶性胶状物质,安全无毒,不引 入杂质并可随沉淀后的不溶性物质一同除去。甲壳素类(如壳聚糖)带正电 荷,可沉降药液中含负电荷的悬浮物。ZTC天然澄清剂可除去鞣质、蛋白 质、胶体等不稳定成分,且对有效成分影响不大。 1.101果汁澄清剂 成分为食用级原料,是水溶性的胶状物质,安全无毒,不引人杂质并可 随沉淀后的不溶性杂质一同除去,通常配5%的水溶液使用。有研究证明, 101果汁澄清剂应用于黄芪、茯苓提取液的澄清,能保持药液中氨基酸与总 有机酸等有效成分的含量。应用于麻黄、莲子心、黄连等提取液的澄清,能 保证药液生物碱的含量。应用于玉屏风口服液的澄清,总浸出物与多糖的含 量均比药典工艺高。但沉淀究竟为何物,对黄酮、蔥醌类化合物有何影响, 仍需进一步研究 2.甲壳素 甲壳素是一种含氨基多糖的天然高分子物质,带正电荷,可沉降药液中 带负电荷的悬浮物。有人将其用于生脉饮的澄清,效果优于醇沉工艺。用于 白芍水提液的澄清,不影响芍药苷的含量。有人将壳聚糖(脱乙酰基甲壳 素)用于黄芪口服液的澄清,既能除去杂质又不影响黄芪甲苷及多糖的含 量。将壳聚糖用丁陈皮、红花等二十味屮药浸提液的澄清,证明均能起到一 定的澄清作用,且能保留葛根、补骨脂、槐米、降香等药物中的有效成分。 但大青叶中的靛玉红、紫苑石油醚提取物中的有效成分,在絮凝液含量偏 低,提示若有效成分水溶性较小时,用壳聚糖作为澄清剂应镇重。 3.ZTC天然澄清剂 可除去鞣质、蛋白质、胶体等不稳定成分,并且不影响中药的有效成 分,如黄酮、生物碱、苷类、氨基酸、多肽、多糖等。实验证明应用于八珍 中药有效成分提取分离技术
口服液的澄清,药液中芍药苷、氨基酸、多糖、总固体的含量高于水醇法所 得药液,药理实验也证明该法所制得药液,其作用优于八珍丸 4.明胶、鞣酸、蛋清及其他 明胶、鞣酸、蛋清主要作用是除去鞣质,还有酶、焦糖等杂质成分。 应用澄清剂澄清提取液,是富集有效成分并一定程度地去除杂质的一种 新型分离技本。澄清剂无毒,适应面广,成本不高。在中药口服液的制备中 的应用越来越多。如玉屏风凵服液、丹参口服液、黄芪口服液、银杏口服液 等的制备 第三节分离纯化技术的前景与展望 随着回妇大自然的潮流和新药研究的需要以及国内中医药走向世界的战 略目标的提出,都为屮药现代化创造了良好的环境,我们应当抓住机遇,把 握机遇,促进中药成药的转化,促进中药现代化的实现。中药提取、分离技 术是改变我国中药制药行业面貌的必要的技术基础。 近年来,一些新兴分离技术的崛起,如膜技术、大孔树脂吸附技术、澄 清技术等,都已经在中药提取、分离、制备方面显示出了各自明显的优势, 不同程度地改进了某些中药制剂的提取上艺,提高了这些中药产品的质量。 (卢艳花 参考文 1北京医学院,北京中失学院主编,屮草药成分化学.北京:人民卫生出版社,1986 2孙文基等,天然药物成分提取分离与制备.北京:中国医药科技出版社,194 3林启寿.中草药成分化学.北京:科学出版社,1977.667 4上海药物研究所,中草药有效成分的提取和分离.第二版.上海:上海科技出版社,1983,43 5孙文基等.药学学报,19,(7):530 6 Hostettmann K, Marston A. Saponins. Cambridge: Cambridge University Press, 199 23 中药有效成分的分离纯化方法