鸟枪法克隆目的基因的局限性 工作量较大,需要了解目的基因的背景知识 不能获得的最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构
鸟枪法克隆目的基因的局限性 工作量较大，需要了解目的基因的背景知识 不能获得的最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构
5目的基因的克隆与基因文库的构建 B CDNA法 CDNA法克隆目的基因的基本战略 CDNA法分离目的基因的基本程序 CDNA法法克隆目的基因的局限性
B cDNA法 5 目的基因的克隆与基因文库的构建 cDNA法克隆目的基因的基本战略 cDNA法分离目的基因的基本程序 cDNA法法克隆目的基因的局限性
CDNA法克隆目的基因的基本战略 cDNA第一链的合成 mDNA ppp G AAAAAAAAAAAAAAOH 3 引物退火 GG AAAAAAAAAAAAAAOH 3 TTTTTTTTTTTTTTp 5 逆转录酶 dNTPs G5‘ppG AAAAAAAAAAAAAAoH 3 TTTTTTTTTTTTTTp 5 CDNA第一链
cDNA法克隆目的基因的基本战略 mDNA cDNA第一链的合成 G 5‘ppp’5G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ G 5‘ppp’5G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ G 5‘ppp’5G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ cDNA第一链 引物 退火 逆转录酶 dNTPs
cDNA第二链的合成 自身引导法:获得的双链cDNA5’端会有几对碱基缺 失 G 5 ppp G AAAAAAAAAAAAAAOH 3 TTTTTTTTTTTTTTp 5 NaoH 煮沸 哩 TTTTTTTTp5 AoH 3 Klenow dNTPs TTTTTTTTTTTTTTp 5 AAAAAAAAAAAAAAOH 3 1 AAAAAAAAAAAAAA
cDNA第二链的合成 NaOH 煮沸 自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺 失 AAAAAAAAAAAAAA G 5‘ppp’5G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTT OH 3’ Klenow dNTPs S1
cDNA第二链的合成 置换合成法:获得的双链cDNA5’端也会有几对碱基缺 G 5 pppG AAAAAAAAAAAAAAOH 3 四中中TTTp5 RNaesh DNApol dNTPs AAAATTTOH 3 TTTTTTTTTTTTTTp 5 TTTTTTTTTTTTTTOH 3 AAAAAAAAAAAAAAp5′ S1 T4-DNA ligase 53 TTTTTTTTTTTTTT 3 AAAAAAAAAAAAAA 5
cDNA第二链的合成 RNaesH DNApol dNTPs 置换合成法：获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺 失G 5‘ppp’5G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAp 5’ 5’ S1 AAAATTTOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5’ TTTTTTTTTTTTTTOH 3’ AAAAAAAAAAAAAA 5’ 5’ TTTTTTTTTTTTTT 3’ 3’ T4-DNA ligase