用国产普通电泳仪。其内加005mPH86的巴比妥缓冲液,加至电泳槽 高度的三分之二处,注意两槽内液面尽量水平。将加好样品的玻板置于电 泳槽上,抗原端接负极,抗体端接正极,用2—4层滤纸浸湿作盐桥,滤纸 与琼脂板联接处为0.5厘米。以板宽度计算电流,以板的长度计算电压 要求电流量为2-3毫安厘米,即大板为20毫安,小板为10毫安。电压 为4-6伏/厘米。通电45分钟—2小时后观察结果 4.结果观察:在黑色背景上方,用散射光多个角度观察,在对孔之间 有白色沉淀线即为阳性对照应出现明显的白色沉淀线。如果抗原,两极微 沉淀条纹不清晰,于37℃保温数小时可增强沉淀条纹的清晰度 5.影响结果的因素 (1)抗原抗体的比例:抗原抗体比例适应时容易出现沉淀带,反之 不易发生。当抗体浓度恒定时,被检血清含甲胎蛋白浓度髙时,作10倍、 20倍或更高倍数稀释可以提高阳性率。随稀释度的增加,抗原抗体的比例 发生变化,沉淀线由靠近抗血清孔向逐步移向两孔中间,并可出现不典型 的沉淀线如弧形、八字须形、斜线形,这些也是阳性,应予注意 (2)几组电泳缓冲液其电泳结果以巴比妥钠一盐酸缓冲液灵敏度 最高。巴比妥一巴比妥钠次之。Tris缓冲液更差 (3)电压与电流时电泳时间需要长些:电压电流增大时,电泳时间 可更短。但电压过高则孔径变形,电流过大抗原抗体蛋白易变性,干扰实 验结果。一般选择每厘米5毫升,电泳时间改为1.5小时。 (四)免疫电泳实验 免疫电泳实验是先将抗原物质在琼脂凝胶中做电泳分离,然后于凝胶 槽中加入抗体血清。使抗原抗体进行双向扩散,在比例适宜部位形成特异 的抗原抗体沉淀弧线。每条沉淀弧线代表一组抗原抗体复合物,故可用抗 原成分分析;且可以根据其迁移率与抗体所出现的特异反应进行鉴定 材料
11 3．电泳 用国产普通电泳仪。其内加 0.05mPH8.6 的巴比妥缓冲液，加至电泳槽 高度的三分之二处，注意两槽内液面尽量水平。将加好样品的玻板置于电 泳槽上，抗原端接负极，抗体端接正极，用 2—4 层滤纸浸湿作盐桥，滤纸 与琼脂板联接处为 0.5 厘米。以板宽度计算电流，以板的长度计算电压。 要求电流量为 2—3 毫安/厘米，即大板为 20 毫安，小板为 10 毫安。电压 为 4—6 伏/厘米。通电 45 分钟—2 小时后观察结果。 4．结果观察：在黑色背景上方，用散射光多个角度观察，在对孔之间 有白色沉淀线即为阳性对照应出现明显的白色沉淀线。如果抗原，两极微 沉淀条纹不清晰，于 37℃保温数小时可增强沉淀条纹的清晰度。 5．影响结果的因素 （1） 抗原抗体的比例：抗原抗体比例适应时容易出现沉淀带，反之 不易发生。当抗体浓度恒定时，被检血清含甲胎蛋白浓度高时，作 10 倍、 20 倍或更高倍数稀释可以提高阳性率。随稀释度的增加，抗原抗体的比例 发生变化，沉淀线由靠近抗血清孔向逐步移向两孔中间，并可出现不典型 的沉淀线如弧形、八字须形、斜线形，这些也是阳性，应予注意。 （2） 几组电泳缓冲液其电泳结果以巴比妥钠—盐酸缓冲液灵敏度 最高。巴比妥—巴比妥钠次之。Tris 缓冲液更差。 （3） 电压与电流时电泳时间需要长些：电压电流增大时，电泳时间 可更短。但电压过高则孔径变形，电流过大抗原抗体蛋白易变性，干扰实 验结果。一般选择每厘米 5 毫升，电泳时间改为 1.5 小时。 （四）免疫电泳实验 免疫电泳实验是先将抗原物质在琼脂凝胶中做电泳分离，然后于凝胶 槽中加入抗体血清。使抗原抗体进行双向扩散，在比例适宜部位形成特异 的抗原抗体沉淀弧线。每条沉淀弧线代表一组抗原抗体复合物，故可用抗 原成分分析；且可以根据其迁移率与抗体所出现的特异反应进行鉴定。 材料：
1.待检标本(抗原):正常人血清。 2.抗体:正常人血清的家兔免疫血清 3.1.5%离子琼脂(系用巴比妥缓冲液配制的) 4.电泳仪 5.巴比妥缓冲液 巴比妥1.84克 巴比妥钠10.3克 蒸馏水1000毫升 pH8.6,离子强度(M)0.05 6.其它:载物玻片,直径3毫米打孔器,20mmx2mm玻璃铸型,微 量进样器 方法: 1.取载物玻片(7.5ⅹ2.5厘米)加上3.5毫升1.5%琼脂凝胶,制成2 毫米厚的琼脂板。 2.按图位置,在琼脂板未凝固时,放入抗血清槽铸型,注意勿使铸型 全部浸入琼脂中,待凝固时再打孔。 3.加待检标本:用微量进样器往孔中加1-5微升。 4.电泳:电压9-7伏/厘米,泳动15-20小时。 5.电泳后取出抗血清槽铸型,加入抗血清,进行双扩散,一般在24 小时内沉淀弧出全 6.观察结果:或描绘、拍照或进行染色,染色后的标本便于结果分析 及保存 图6兔疫电泳抗原孔和抗体格位量示意图
12 1．待检标本（抗原）：正常人血清。 2．抗体：正常人血清的家兔免疫血清。 3．1.5%离子琼脂（系用巴比妥缓冲液配制的） 4．电泳仪 5．巴比妥缓冲液： 巴比妥 1.84 克 巴比妥钠 10.3 克 蒸馏水 1000 毫升 pH8.6，离子强度（M）0.05 6．其它：载物玻片，直径 3 毫米打孔器，20mmⅹ2mm 玻璃铸型，微 量进样器。 方法： 1.取载物玻片（7.5ⅹ2.5 厘米）加上 3.5 毫升 1.5%琼脂凝胶，制成 2 毫米厚的琼脂板。 2.按图位置，在琼脂板未凝固时，放入抗血清槽铸型，注意勿使铸型 全部浸入琼脂中，待凝固时再打孔。 3.加待检标本：用微量进样器往孔中加 1—5 微升。 4.电泳：电压 9—7 伏/厘米，泳动 15—20 小时。 5.电泳后取出抗血清槽铸型，加入抗血清，进行双扩散，一般在 24 小时内沉淀弧出全。 6．观察结果：或描绘、拍照或进行染色，染色后的标本便于结果分析 及保存。 图 6 免疫电泳抗原孔和抗体槽位置示意图
(五)火箭电泳试验 火箭电泳实际是一种定量免疫电泳。其原理为:在电场作用下,抗原 在含定量抗体的琼脂介质中泳动,二者比例在合适时在较短时间内形成状 似火箭或锥形的沉淀线,而此沉淀线的高度常与抗原量成正比关系,因此 本法可以测定样品中抗原的含量 材料: 1.诊断血清(抗体):抗人IgG或lgA免疫血清 2.待检血清(抗原):人血清 3.参考血清 4.pH86,离子强度005M巴比妥缓冲液配制(见对流免疫电泳试验) 5.其它:琼脂粉,微量进样器,打孔器,玻璃板,电泳仪 方法: 1.抗体琼脂板的制备 同单向扩散法,但注意稀释液应用pH86离子强度005M的巴比妥缓 冲液。 2.打孔见下图 图7火箭电泳抗原孔位置图 3.将用缓冲液稀释的适宜浓度的参考血清及适当稀释的抗原(人血清) 分别加入各孔中,每孔10或20微升,要求加量准确而不外溢。 4.把加完样的免疫琼脂板放入电泳槽中进行电泳,电压4-6伏/厘米 电泳时间1-5小时,直到大部分抗原孔前端出现顶端尖窄而完全闭合的火
13 （五）火箭电泳试验 火箭电泳实际是一种定量免疫电泳。其原理为：在电场作用下，抗原 在含定量抗体的琼脂介质中泳动，二者比例在合适时在较短时间内形成状 似火箭或锥形的沉淀线，而此沉淀线的高度常与抗原量成正比关系，因此 本法可以测定样品中抗原的含量。 材料： 1．诊断血清（抗体）：抗人 IgG 或 IgA 免疫血清 2．待检血清（抗原）：人血清 3．参考血清 4．pH8.6，离子强度 0.05M 巴比妥缓冲液配制（见对流免疫电泳试验） 5．其它：琼脂粉，微量进样器，打孔器，玻璃板，电泳仪 方法： 1．抗体琼脂板的制备 同单向扩散法，但注意稀释液应用 pH8.6 离子强度 0.05M 的巴比妥缓 冲液。 2．打孔见下图 图 7 火箭电泳抗原孔位置图 3．将用缓冲液稀释的适宜浓度的参考血清及适当稀释的抗原（人血清） 分别加入各孔中，每孔 10 或 20 微升，要求加量准确而不外溢。 4．把加完样的免疫琼脂板放入电泳槽中进行电泳，电压 4—6 伏/厘米， 电泳时间 1—5 小时，直到大部分抗原孔前端出现顶端尖窄而完全闭合的火
箭状沉淀线,关闭电源。 5.取下琼脂板,以抗原孔中心为起点,量出各火箭状沉淀线的高度 同单向琼脂扩散法绘制标准曲线,查出待检血清中lg含量
14 箭状沉淀线，关闭电源。 5．取下琼脂板，以抗原孔中心为起点，量出各火箭状沉淀线的高度。 同单向琼脂扩散法绘制标准曲线，查出待检血清中 Ig 含量
实验三凝集反应 当颗粒性抗原与其相应抗血清混合时,在有一定浓度的电解质环境中 抗原凝集成大小不等的凝集块,叫做凝集反应。 凝集反应广泛地应用于疾病的诊断和各种抗原性质的分析。即可用已 知免疫血清来检査未知抗原,亦可用己知抗原检测特异性抗体。 直接凝集反应 颗粒抗原与抗体直接结合出现凝集现象叫直接凝集反应。 (一)玻片凝集反应 材料: 1.诊断血清:1:10稀释的伤寒杆菌诊断血清 2.菌种:伤寒杆菌、痢疾杆菌24小时琼脂斜面培养物 3.生理盐水、载玻片、毛细吸管 方法: 1.取清洁玻片一张,用蜡笔划为三格,并注明号码。无菌操作下,用 接种环于1、2格内加1:10稀释伤寒杆菌诊断血清1-2滴,第三格加1-2 滴生理盐水。 2.无菌操作下,用接种环取伤寒杆菌培养物少许,混于第三格中,再 混于第一格中(不能先混第一格再混第三格,因为这样将使诊断血清混入 盐水而影响对照结果),将细菌与盐水或血清混合均匀使呈乳状液。此时取 菌量不可过多,使悬液呈轻度乳浊即可。 3.同法取枯草杆菌培养物少许,于第二格内混匀。 4.轻轻摇动玻片,经1-2分钟后肉眼观察,出现乳白色凝集块者,即 为阳性反应;仍为平等的乳浊液者,即为阴性反应。如结果不够清晰,可 将玻片放于低倍显微镜下观察
15 实验三 凝集反应 当颗粒性抗原与其相应抗血清混合时，在有一定浓度的电解质环境中， 抗原凝集成大小不等的凝集块，叫做凝集反应。 凝集反应广泛地应用于疾病的诊断和各种抗原性质的分析。即可用已 知免疫血清来检查未知抗原，亦可用已知抗原检测特异性抗体。 一．直接凝集反应 颗粒抗原与抗体直接结合出现凝集现象叫直接凝集反应。 （一） 玻片凝集反应 材料： 1．诊断血清：1：10 稀释的伤寒杆菌诊断血清 2．菌种：伤寒杆菌、痢疾杆菌 24 小时琼脂斜面培养物 3．生理盐水、载玻片、毛细吸管 方法： 1．取清洁玻片一张，用蜡笔划为三格，并注明号码。无菌操作下，用 接种环于 1、2 格内加 1：10 稀释伤寒杆菌诊断血清 1-2 滴，第三格加 1-2 滴生理盐水。 2．无菌操作下，用接种环取伤寒杆菌培养物少许，混于第三格中，再 混于第一格中（不能先混第一格再混第三格，因为这样将使诊断血清混入 盐水而影响对照结果），将细菌与盐水或血清混合均匀使呈乳状液。此时取 菌量不可过多，使悬液呈轻度乳浊即可。 3．同法取枯草杆菌培养物少许，于第二格内混匀。 4．轻轻摇动玻片，经 1-2 分钟后肉眼观察，出现乳白色凝集块者，即 为阳性反应；仍为平等的乳浊液者，即为阴性反应。如结果不够清晰，可 将玻片放于低倍显微镜下观察