二)琼脂扩散试验 琼脂扩散是抗原抗体在凝胶中所呈现的一种沉淀反应。 抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相遇时,便出现可见的白色沉淀线 这种沉淀线是一组抗原抗体的特异性复合物。如果凝胶中有多种不同抗原 抗体存在时,便依各自扩散速度的差异,在适当部位形成独立的沉淀线, 因此广泛地用于抗原成分的分析。琼脂扩散试验可根据抗原抗体反应的方 式和特性分为单向免疫扩散、双向免疫扩散、免疫电泳、对流免疫电泳、 单向及双向火箭电泳试验。 (1)单向琼脂扩散试验 材料: 1.诊断血清(抗体:抗人lgG或lgA免疫血清) 2.待检血清(抗原):人血清 3.参考血清:全国统一人血清兔疫球蛋白参考血清(批号不同,免疫 球蛋白含量不同)。 4.其它:生理盐水、琼脂粉、微量进样器、打孔器、玻璃板、湿盒等。 方法: 将适当稀释(事先滴定)的诊断血清与予溶化的2%琼脂在60℃水 浴预热数分钟后等量混合均匀制成免疫琼脂板。 2.在免疫琼脂板上按一定距离(1.2-1.5厘米)打孔,见图1 ○○○ 图1单向琼脂扩散试验抗原孔位置示意图 l5孔加参考血清,6-7孔加待检血清 6
6 （二）.琼脂扩散试验 琼脂扩散是抗原抗体在凝胶中所呈现的一种沉淀反应。 抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相遇时，便出现可见的白色沉淀线。 这种沉淀线是一组抗原抗体的特异性复合物。如果凝胶中有多种不同抗原 抗体存在时，便依各自扩散速度的差异，在适当部位形成独立的沉淀线， 因此广泛地用于抗原成分的分析。琼脂扩散试验可根据抗原抗体反应的方 式和特性分为单向免疫扩散、双向免疫扩散、免疫电泳、对流免疫电泳、 单向及双向火箭电泳试验。 （1） 单向琼脂扩散试验 材料： 1．诊断血清（抗体：抗人 IgG 或 IgA 免疫血清） 2．待检血清（抗原）：人血清 3．参考血清：全国统一人血清免疫球蛋白参考血清（批号不同，免疫 球蛋白含量不同）。 4．其它：生理盐水、琼脂粉、微量进样器、打孔器、玻璃板、湿盒等。 方法： 1．将适当稀释（事先滴定）的诊断血清与予溶化的 2%琼脂在 60℃水 浴预热数分钟后等量混合均匀制成免疫琼脂板。 2．在免疫琼脂板上按一定距离（1.2—1.5 厘米）打孔，见图 1。 图 1 单向琼脂扩散试验抗原孔位置示意图 1-5 孔加参考血清，6-7 孔加待检血清
3.向孔内滴加1:2,1:4,1:8,1:16,1:32稀释的参考血清及 l:10稀释的待检血清,每孔10微升,此时加入的抗原液面应与琼脂板 平,不得外溢。 4.已经加样的免疫琼脂板置湿盒中37℃温箱扩散24小时 5.测定各孔形成的沉淀环直径(mm),用参考血清各稀释度测定值绘出 标准曲线,再由标准曲线查出被检血清中免疫球蛋白的含量 (2)双向琼脂扩散试验 材料: 1.诊断血清:兔抗人血清 2.待测血清:人血清 3.阴性对照血清 4.其它:生理盐水、琼脂粉、载玻片、打孔器、微量进样器等 方法: 1.取一清洁载玻片,倾注3.5-40毫升加热熔化的1%食盐琼脂制成 琼脂板 2.凝固后,用直径3毫米打孔器,孔间距为5毫米。孔的排列方式如 图2所示 图2双向琼脂扩散原抗体孔位量示意图 3.用微量进样器于中央孔加抗体,于周围孔加各种抗原。加样时勿使 样品外溢或在边缘残存小气泡,以免影响扩散结果。 4.加样后的琼脂板收入湿盒内置37℃温箱中扩散24-48小时
7 3．向孔内滴加 1：2，1：4，1：8，1：16，1：32 稀释的参考血清及 1：10 稀释的待检血清，每孔 10 微升，此时加入的抗原液面应与琼脂板一 平，不得外溢。 4．已经加样的免疫琼脂板置湿盒中 37℃温箱扩散 24 小时。 5．测定各孔形成的沉淀环直径(mm),用参考血清各稀释度测定值绘出 标准曲线，再由标准曲线查出被检血清中免疫球蛋白的含量。 （2） 双向琼脂扩散试验 材料： 1．诊断血清：兔抗人血清 2．待测血清：人血清 3．阴性对照血清 4．其它：生理盐水、琼脂粉、载玻片、打孔器、微量进样器等。 方法： 1．取一清洁载玻片，倾注 3.5—4.0 毫升加热熔化的 1%食盐琼脂制成 琼脂板。 2．凝固后，用直径 3 毫米打孔器，孔间距为 5 毫米。孔的排列方式如 图 2 所示。 图 2 双向琼脂扩散原抗体孔位置示意图 3．用微量进样器于中央孔加抗体，于周围孔加各种抗原。加样时勿使 样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。 4．加样后的琼脂板收入湿盒内置 37℃温箱中扩散 24—48 小时
5.结果观察:若凝胶中抗原抗体是特异性的,则形成抗原一抗体复合 物,在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线,为阳性反应。若在72小时 仍未出现沉淀线则为阴性反应。实验时至少要做一阳性对照。出现阳性对 照与被检样品的沉淀线发生融合,才能确定待检样品为真正阳性 6.结果分析:琼脂扩散结果受许多因素影响。 ①抗原特异性与沉淀线形状的关系:在相邻两完全相同的抗原与抗体 反应时,则可出现两单沉淀线的融合。反之,如相邻抗原完全不同时,则 出现沉淀线之交叉;两种抗原部分相同时,则出现沉淀线的部分融合。见 图3 ④) 图3双扩散试验结果示意图 L:已知抗体a、b:阳性对照 c、d、e、f:被检材料 ②抗原浓度与沉淀先导形状的关系:两相邻抗原浓度相同,形成对称 相融合的沉淀线;如果两抗原浓度不同,则沉淀线不对称,移向低浓度的 一边。见图4 图4抗原特异性与沉淀线形状的关系 a、b:抗体A、A、B:抗原 A、B完全不同A、A部分相同
8 5．结果观察：若凝胶中抗原抗体是特异性的，则形成抗原—抗体复合 物，在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线，为阳性反应。若在 72 小时 仍未出现沉淀线则为阴性反应。实验时至少要做一阳性对照。出现阳性对 照与被检样品的沉淀线发生融合，才能确定待检样品为真正阳性。 6．结果分析：琼脂扩散结果受许多因素影响。 ①抗原特异性与沉淀线形状的关系：在相邻两完全相同的抗原与抗体 反应时，则可出现两单沉淀线的融合。反之，如相邻抗原完全不同时，则 出现沉淀线之交叉；两种抗原部分相同时，则出现沉淀线的部分融合。见 图 3。 图 3 双扩散试验结果示意图 A：已知抗体 a、b：阳性对照 c、d、e、f：被检材料 ②抗原浓度与沉淀先导形状的关系：两相邻抗原浓度相同，形成对称 相融合的沉淀线；如果两抗原浓度不同，则沉淀线不对称，移向低浓度的 一边。见图 4。 图 4 抗原特异性与沉淀线形状的关系 a、b：抗体 A、A’、B：抗原 A、B 完全不同 A、A’部分相同
③温度对沉淀线的影响:在一定范围内,温度扩散快。通常反应在 0-37℃下进行。在双向扩散时,为了减少沉淀线变形并保持其清晰度,可 在37℃下形成沉淀线,然后置于室温或冰箱(4℃)中为佳。 ④琼脂浓度对沉淀线形成速度的影响:一般来说,琼脂浓度越大,沉 淀线出现越慢。 ⑤参加扩散的抗原与抗体间的距离对沉淀线形成的影响:抗原、抗体 相距越远,沉淀线形成的越慢,所以在微量玻片法时,孔间距离以 0.25-0.5cm为好,距离远影响反应速度。当然孔距过远,沉淀线的密度过 大,容易发生融合,有碍对沉淀线数目的确定。 ⑥时间对沉淀线的影响:沉淀线形成一般在1-3天出现,14-21天出现 的数目最多。玻片法可在1-2小时出现,一般观察72小时,放量过久可出 现沉淀线重合消失 (三)对流免疫电泳试验 对流免疫电泳是在琼脂扩散基础上结合电泳技术而建立的一种简便而 快速的方法。此方法能在短时间内出现结果,故可用于快速诊断,敏感性 比双向扩散技术高10-15倍。 血清蛋白在PH86条件下带负电荷,所以在电场作用下都向E极移动 但由于抗体分子在这样的PH条件下只带微弱的负电荷,而且它的分子量 又较大(为r球蛋白)。所以游动慢。更重要的是抗体分子受电渗作用影响 较大,也就是说点渗作用大于它本身的迁移率。所谓电渗作用是指在电场 中溶液对于一个固定固体的相对移动。琼脂是一种酸性物质,在碱性缓冲 液中进行电泳,它带有负电荷,而与琼脂相接触的水溶液就带正电荷,这 样的液体便向负极移动抗体分子就是随着带正电荷的液体向负极移动的 而一般的蛋白质(如血清抗原)也受电渗作用的影响,使泳动速度减慢, 但它的电泳迁移率远远大于电渗作用。这样抗原体就达到了定向对流,在 两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的沉淀线
9 ③温度对沉淀线的影响：在一定范围内，温度扩散快。通常反应在 0-37℃下进行。在双向扩散时，为了减少沉淀线变形并保持其清晰度，可 在 37℃下形成沉淀线，然后置于室温或冰箱（4℃）中为佳。 ④琼脂浓度对沉淀线形成速度的影响：一般来说，琼脂浓度越大，沉 淀线出现越慢。 ⑤参加扩散的抗原与抗体间的距离对沉淀线形成的影响：抗原、抗体 相距越远，沉淀线形成的越慢，所以在微量玻片法时，孔间距离以 0.25-0.5cm 为好，距离远影响反应速度。当然孔距过远，沉淀线的密度过 大，容易发生融合，有碍对沉淀线数目的确定。 ⑥时间对沉淀线的影响：沉淀线形成一般在 1-3 天出现，14-21 天出现 的数目最多。玻片法可在 1-2 小时出现，一般观察 72 小时，放量过久可出 现沉淀线重合消失。 （三）对流免疫电泳试验 对流免疫电泳是在琼脂扩散基础上结合电泳技术而建立的一种简便而 快速的方法。此方法能在短时间内出现结果，故可用于快速诊断，敏感性 比双向扩散技术高 10-15 倍。 血清蛋白在 PH8.6 条件下带负电荷，所以在电场作用下都向 E 极移动。 但由于抗体分子在这样的 PH 条件下只带微弱的负电荷，而且它的分子量 又较大（为 r 球蛋白）。所以游动慢。更重要的是抗体分子受电渗作用影响 较大，也就是说点渗作用大于它本身的迁移率。所谓电渗作用是指在电场 中溶液对于一个固定固体的相对移动。琼脂是一种酸性物质，在碱性缓冲 液中进行电泳，它带有负电荷，而与琼脂相接触的水溶液就带正电荷，这 样的液体便向负极移动。抗体分子就是随着带正电荷的液体向负极移动的。 而一般的蛋白质（如血清抗原）也受电渗作用的影响，使泳动速度减慢， 但它的电泳迁移率远远大于电渗作用。这样抗原体就达到了定向对流，在 两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的沉淀线
材料 1.诊断血清:免抗人免疫血清 2.待检血清:人血清 3.阴性对照血清 4.PH86,离子强度0.05M的巴比妥缓冲液配置 巴比妥钠103克 巴比妥 1.84克 蒸馏水 1000毫升 5.缓冲琼脂板:将纯化的琼脂用PH86离子强度0025的巴比妥缓冲 液(用005M的巴比妥缓冲液稀释一倍即可)配成15%的琼脂,加入 0.01-0.02%流柳汞防腐,保存冰箱内备用。 6.电泳仪 7.其他:生理盐水、打孔器、微量进样器。 方法: 1.琼脂板的制备根据需要可选用大玻板(6厘米×9厘米)和(小玻 片)两种。大玻板约需琼脂10毫升,小玻片约需35毫升,凝固后按图打 孔,方法同琼脂扩散试验 2.加样:左侧孔内加患者血清(原血清及10倍稀释血清各占一孔), 右侧内加抗血清,每片应有阳性对照。 图5对流兔疫电泳抗原孔、抗体孔位置示意图
10 材料： 1．诊断血清：免抗人免疫血清 2．待检血清：人血清 3．阴性对照血清 4．PH8.6,离子强度 0.05M 的巴比妥缓冲液配置 巴比妥钠 10.3 克 巴比妥 1.84 克 蒸馏水 1000 毫升 5．缓冲琼脂板：将纯化的琼脂用 PH8.6 离子强度 0.025 的巴比妥缓冲 液（用 0.05M 的巴比妥缓冲液稀释一倍即可）配成 1.5%的琼脂，加入 0.01-0.02%流柳汞防腐，保存冰箱内备用。 6．电泳仪 7．其他：生理盐水、打孔器、微量进样器。 方法： 1．琼脂板的制备根据需要可选用大玻板（6 厘米×9 厘米）和（小玻 片）两种。大玻板约需琼脂 10 毫升，小玻片约需 3.5 毫升，凝固后按图打 孔，方法同琼脂扩散试验。 2．加样：左侧孔内加患者血清（原血清及 10 倍稀释血清各占一孔）， 右侧内加抗血清，每片应有阳性对照。 图 5 对流免疫电泳抗原孔、抗体孔位置示意图