(二)试管凝集反应 为一种定量试验,用已知抗原检查血清中有无特异抗体,并测定其相 对含量。 材料: 1.诊断血清1:10稀释伤寒杆菌“H”血清,1:10稀释伤寒杆菌“O” 2.菌液:伤寒杆菌“H”菌液,伤寒杆菌“O”菌液。 3.生理盐水,小试管,吸管。 方法: 1.取洁净小试管14只分两排排列于试管架上,每排7只依次用蜡笔 注明号码,于每管中分别加入0.5毫升生理盐水 2.在第1排1管中加入1:10稀释伤寒H血清0.5毫升,于管内连续 吹吸3次,使血清与盐水充分混合,而后吸岀0.5毫升注入第2管,同样 予以混匀后吸出0.5毫升注入第3管。依次类推,稀释到第6管,自第6 管吸出0.5毫升弃去。此时,自第1管至第6管的血清稀释倍数为1:20, 1:40,1:80,1:160,1:320,1:640。第7管不加血清作为对照。 3.同法用吸管吸取1:10稀释伤寒杄菌O血清加入第2排第1管, 并依次如上法予以稀释 4.用移液管吸取伤寒杄菌H菌液,加收第1排各管中每管0.5毫升(由 盐水对照管开始,依次由后向前加入)此时血清稀释倍数又增加了一倍。 5.同法于第2排各管中加入伤寒O菌液0.5毫升 6.将各管振荡混匀,放37℃水浴箱中2-4小时或37℃孵育箱中过夜 次日取出观察结果 观察结果 1.观察切勿摇动试管,以免凝集块分散
16 （二） 试管凝集反应 为一种定量试验，用已知抗原检查血清中有无特异抗体，并测定其相 对含量。 材料： 1．诊断血清 1：10 稀释伤寒杆菌“H”血清，1：10 稀释伤寒杆菌“O” 血清。 2．菌液：伤寒杆菌“H”菌液，伤寒杆菌“O” 菌液。 3．生理盐水，小试管，吸管。 方法： 1．取洁净小试管 14 只分两排排列于试管架上，每排 7 只依次用蜡笔 注明号码，于每管中分别加入 0.5 毫升生理盐水。 2．在第 1 排 1 管中加入 1：10 稀释伤寒 H 血清 0.5 毫升，于管内连续 吹吸 3 次，使血清与盐水充分混合，而后吸出 0.5 毫升注入第 2 管，同样 予以混匀后吸出 0.5 毫升注入第 3 管。依次类推，稀释到第 6 管，自第 6 管吸出 0.5 毫升弃去。此时，自第 1 管至第 6 管的血清稀释倍数为 1：20， 1：40，1：80，1：160，1：320，1：640。第 7 管不加血清作为对照。 3．同法用吸管吸取 1：10 稀释伤寒杆菌 O 血清加入第 2 排第 1 管， 并依次如上法予以稀释。 4．用移液管吸取伤寒杆菌 H 菌液，加收第 1 排各管中每管 0.5 毫升（由 盐水对照管开始，依次由后向前加入）此时血清稀释倍数又增加了一倍。 5．同法于第 2 排各管中加入伤寒 O 菌液 0.5 毫升。 6．将各管振荡混匀，放 37℃水浴箱中 2—4 小时或 37℃孵育箱中过夜 次日取出观察结果。 观察结果： 1．观察切勿摇动试管，以免凝集块分散
2.先看对照管,此管应无凝集现象,管内液体仍成混浊状态。但如放 置时间较长,细菌堆于管底成小圆点状,为阴性反应 3.试验管应自第1管看起,如有凝集时则于管底有不同大小的圆片状 边缘不整齐的凝集物,上清则澄清透明或不同程度混浊。凝集的强弱可用 “+”号表示如下: “++”凝集很强,管内液体完全澄清,凝集块完全沉于管底 “艹+-”凝集强,管内液体不完全澄清稍有轻度混浊,凝集块沉于管底 “艹+”凝集中等强度,液体半澄清,凝集块沉于管底 +”凝集弱,管内液体混浊,少量凝集块沉于管底 ”不凝集,管内液体和对照管同样混浊,无凝集块 4.轻轻振荡各管,观察凝集块的状态,对照管的细菌在振荡时呈烟雾 状上升,随即消散,细菌分散仍呈混浊状态。“H”菌液的凝集块疏松呈棉 状,大片沉于管底轻摇即升起,并极易破碎。“O”菌液凝集呈紧密颗粒状, 沉于管底坚实致密,轻轻振摇不易升起,凝集颗粒较小不易摇碎 5.记录观察的结果并制定凝集效价。通常以能产生明显凝集(++) 的血清大稀释倍数作为该血清的凝集效价。如血清的最低稀释度(即第1 管1:40)仍无凝集应报告为低于1:40。如血清的最高稀释度(即第6 管1:1280)仍显完全凝集现象。,应报该血清效价高于1:1280。 二.间接凝集反应 将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关的颗粒载体上,然后与相应的 抗体结合,也可出现颗粒载体的凝集现象,称为间接凝集反应。间接凝 集反应比直接凝集反应敏感性为高,可用于微量抗体或抗原的检查 (一)间接血球凝集试验 间接血球凝集试验是根据红血球表面的吸附作用而建立起来的。将细 菌可溶性抗原提出使之吸附于红血球表面,此时红血球即称为“致敏红血
17 2．先看对照管，此管应无凝集现象，管内液体仍成混浊状态。但如放 置时间较长，细菌堆于管底成小圆点状，为阴性反应。 3．试验管应自第 1 管看起，如有凝集时则于管底有不同大小的圆片状 边缘不整齐的凝集物，上清则澄清透明或不同程度混浊。凝集的强弱可用 “+”号表示如下： “++++”凝集很强，管内液体完全澄清，凝集块完全沉于管底； “+++”凝集强，管内液体不完全澄清稍有轻度混浊，凝集块沉于管底； “++”凝集中等强度，液体半澄清，凝集块沉于管底； “+”凝集弱，管内液体混浊，少量凝集块沉于管底； “－”不凝集，管内液体和对照管同样混浊，无凝集块。 4．轻轻振荡各管，观察凝集块的状态，对照管的细菌在振荡时呈烟雾 状上升，随即消散，细菌分散仍呈混浊状态。“H”菌液的凝集块疏松呈棉 状，大片沉于管底轻摇即升起，并极易破碎。“O”菌液凝集呈紧密颗粒状， 沉于管底坚实致密，轻轻振摇不易升起，凝集颗粒较小不易摇碎。 5．记录观察的结果并制定凝集效价。通常以能产生明显凝集（++） 的血清大稀释倍数作为该血清的凝集效价。如血清的最低稀释度（即第 1 管 1：40）仍无凝集应报告为低于 1：40。如血清的最高稀释度（即第 6 管 1：1280）仍显完全凝集现象。，应报该血清效价高于 1：1280。 二．间接凝集反应 将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关的颗粒载体上，然后与相应的 抗体结合，也可出现颗粒载体的凝集现象，称为间接凝集反应。间接凝 集反应比直接凝集反应敏感性为高，可用于微量抗体或抗原的检查。 （一） 间接血球凝集试验 间接血球凝集试验是根据红血球表面的吸附作用而建立起来的。将细 菌可溶性抗原提出使之吸附于红血球表面，此时红血球即称为“致敏红血
球”。这种致敏的红血球具有细菌的抗原性,与相应的抗血清相遇可产生凝 集现象 间接血凝抗原的制备可用加碱或加热的方法使菌体中的多糖物质浸 出,去除类脂以免干扰红血球的吸附作用。但如系蛋白质时则用来吸附的 红血球需先用鞣酸予以处理。 材料: 1.抗原一伤寒杆菌O抗原 2.免疫血清:伤寒杆菌O901免疫兔血清 3.25%绵羊红血球悬液,生理盐水,试管吸管等 方法: 1.“O”抗原的制备 将每毫升100亿的伤寒杆菌“O”菌悬液,置100℃水浴中2小时,离 心沉淀吸取上清夜,分装无菌试管,放4℃冰箱备用。 2.致敏红血球悬液制备 取一定稀释度的抗原加等量2.5%绵羊红血球悬液,混合后放37℃水浴 箱中,每隔15分钟取出振摇一次,共经2小时。然后取出,用生理盐水洗 涤3次,而配制成0.5%悬液即成。 3.试验步骤: (1)小试管9只标好号码于试管架上 (2)第1管加入0.9毫升生理盐水,其余各管各加入0.5毫升。 (3)以吸管吸取已加热灭菌的免疫血清0.1毫升加入第1管,混匀后 吸取0.5毫升注入第2管,同样第2管的血清与盐水混匀后吸取0.5毫升注 入第3管。如此依次稀释直至第8管。自第8管吸出0.5毫升弃去。第9 管不加血清作对照 4)于每管加入0.5毫升已经致敏的0.5%绵羊红血球悬液,混匀后
18 球”。这种致敏的红血球具有细菌的抗原性，与相应的抗血清相遇可产生凝 集现象。 间接血凝抗原的制备可用加碱或加热的方法使菌体中的多糖物质浸 出，去除类脂以免干扰红血球的吸附作用。但如系蛋白质时则用来吸附的 红血球需先用鞣酸予以处理。 材料： 1．抗原—伤寒杆菌 O 抗原 2．免疫血清：伤寒杆菌 O901 免疫兔血清 3．25%绵羊红血球悬液，生理盐水，试管吸管等 方法： 1．“O”抗原的制备： 将每毫升 100 亿的伤寒杆菌“O”菌悬液，置 100℃水浴中 2 小时，离 心沉淀吸取上清夜，分装无菌试管，放 4℃冰箱备用。 2．致敏红血球悬液制备： 取一定稀释度的抗原加等量 2.5%绵羊红血球悬液，混合后放 37℃水浴 箱中，每隔 15 分钟取出振摇一次，共经 2 小时。然后取出，用生理盐水洗 涤 3 次，而配制成 0.5%悬液即成。 3．试验步骤： （1）小试管 9 只标好号码于试管架上。 （2）第 1 管加入 0.9 毫升生理盐水，其余各管各加入 0.5 毫升。 （3）以吸管吸取已加热灭菌的免疫血清 0.1 毫升加入第 1 管，混匀后 吸取 0.5 毫升注入第 2 管，同样第 2 管的血清与盐水混匀后吸取 0.5 毫升注 入第 3 管。如此依次稀释直至第 8 管。自第 8 管吸出 0.5 毫升弃去。第 9 管不加血清作对照。 （4）于每管加入 0.5 毫升已经致敏的 0.5%绵羊红血球悬液，混匀后
放入37℃水浴中2小时后观察结果。凡最高血清稀释度的免疫血清试管中 呈现完全血凝者,即为该血清的间接血清效价。 (二)间接凝集抑制试验 若使可溶性抗原与相应抗体先混合,充分作用后再加入有关的免疫微 球,因抗体已被可溶性抗原结合,不再出现免疫微球的被动凝集现象,叫 间接凝集抑制试验,临床化验检査中常用的免疫妊娠试验就是一种间接凝 集抑制试验。 妊娠试验 孕妇尿中绒毛膜促性腺激素的含量比正常尿高。因此当往尿中加入抗 绒毛膜促性腺激素抗体时,由于发生抗原抗体反应的结果,抗体被消耗, 此时再往尿中加入胶乳抗原(吸附有人类绒毛膜促性腺激素的聚苯乙烯乳 胶颗粒)。不发生反应,抗原仍呈乳状液体,即为妊娠试验阳性。反之,被 检尿中绒毛膜促性腺激素含量甚少(非妊娠尿)不足以把加入的抗体消耗 当胶乳抗原加入后,抗体便与抗原结合发生反应。出现均匀细小颗粒,妊 娠试验为阴性。 材料: 抗原:吸附有人类绒毛膜促性腺激素的聚苯乙烯抗原 2.抗体:抗人类绒毛膜促性腺激素抗体血清 3.被检材料:孕妇尿 4.正常尿作对照用 5.黑反应板1块 6.滴管3只 方法: 1.用清洁滴管在反应板上滴加一滴被检尿
19 放入 37℃水浴中 2 小时后观察结果。凡最高血清稀释度的免疫血清试管中 呈现完全血凝者，即为该血清的间接血清效价。 （二） 间接凝集抑制试验 若使可溶性抗原与相应抗体先混合，充分作用后再加入有关的免疫微 球，因抗体已被可溶性抗原结合，不再出现免疫微球的被动凝集现象，叫 间接凝集抑制试验，临床化验检查中常用的免疫妊娠试验就是一种间接凝 集抑制试验。 妊娠试验： 孕妇尿中绒毛膜促性腺激素的含量比正常尿高。因此当往尿中加入抗 绒毛膜促性腺激素抗体时，由于发生抗原抗体反应的结果，抗体被消耗， 此时再往尿中加入胶乳抗原（吸附有人类绒毛膜促性腺激素的聚苯乙烯乳 胶颗粒）。不发生反应，抗原仍呈乳状液体，即为妊娠试验阳性。反之，被 检尿中绒毛膜促性腺激素含量甚少（非妊娠尿）不足以把加入的抗体消耗， 当胶乳抗原加入后，抗体便与抗原结合发生反应。出现均匀细小颗粒，妊 娠试验为阴性。 材料： 1．抗原：吸附有人类绒毛膜促性腺激素的聚苯乙烯抗原 2．抗体：抗人类绒毛膜促性腺激素抗体血清 3．被检材料：孕妇尿 4．正常尿作对照用 5．黑反应板 1 块 6．滴管 3 只 方法： 1．用清洁滴管在反应板上滴加一滴被检尿
2.再往尿滴加抗血清一滴,轻轻摇动,充分混匀 3.滴加一滴胶乳抗原,缓慢摇动3-5分钟,在较强光线下,观察结 果。出现均匀一致的细小颗粒为阴性反应,怀孕。 注意事项 1.试验材料用具用前使温度接近室温(20℃左右) 2.被检尿太混浊,需要小心过滤 3.尿中有蛋白及血液时,不宜进行此试验。 三)协同凝集试验 金黄色葡萄球菌细胞壁成分中的A蛋白能与人及多种哺乳动物(猪 兔、羊、鼠等)血清中IgG类抗体的Fc段结合。lgG的Fe段与SpA结 合后,两个Fab段暴露在葡萄球体表面,仍保持其抗体活性和特异性当其 与特异性抗原相遇时,也出现特异凝集现象。在以凝集反应中,金黄色葡 萄球菌菌体成了IgG抗体的载体称为协同凝集反应本反应也可用于检测 微量抗原 A.材料: 抗原可溶性伤寒杆菌O抗原 2.免疫血清:伤寒杆菌0901免疫兔血清 3.10% CoWan株金黄色葡萄球菌(含大量蛋白A)的菌液 4.PBS0.5%甲醛PBS,吸管、滴管、玻片等 B.方法 1.10%葡萄球菌菌悬液的制备: CoWan株葡萄球菌接种于柯氏瓶 37℃培养18-24小时,用PBS洗下菌苔,每分钟2500转速度离心20分钟 沉淀菌用PBS洗两次后,用0.5%甲醛(用PBS配置)在室温中固定3小 时。置于80℃水浴中4分钟以破坏菌体的自源性分解酶。再用PBS洗涤2 次后配成10%菌悬液
20 2．再往尿滴加抗血清一滴，轻轻摇动，充分混匀。 3．滴加一滴胶乳抗原，缓慢摇动 3—5 分钟，在较强光线下，观察结 果。出现均匀一致的细小颗粒为阴性反应，怀孕。 注意事项： 1．试验材料用具用前使温度接近室温（20℃左右） 2．被检尿太混浊，需要小心过滤。 3．尿中有蛋白及血液时，不宜进行此试验。 （三） 协同凝集试验 金黄色葡萄球菌细胞壁成分中的 A 蛋白能与人及多种哺乳动物（猪、 兔、羊、鼠等）血清中 IgG 类抗体 的 Fc 段结合。IgG 的 Fe 段与 SpA 结 合后，两个 Fab 段暴露在葡萄球体表面，仍保持其抗体活性和特异性当其 与特异性抗原相遇时，也出现特异凝集现象。在以凝集反应中，金黄色葡 萄球菌菌体成了 IgG 抗体的载体,称为协同凝集反应.本反应也可用于检测 微量抗原. A. 材料： 1. 抗原:可溶性伤寒杆菌 O 抗原 2. 免疫血清：伤寒杆菌 0901 免疫兔血清 3. 10%CoWan1 株金黄色葡萄球菌（含大量蛋白 A）的菌液 4. PBS0.5%甲醛 PBS，吸管、滴管、玻片等 B. 方法： 1．10%葡萄球菌菌悬液的制备：CoWan1 株葡萄球菌接种于柯氏瓶， 37℃培养 18-24 小时，用 PBS 洗下菌苔，每分钟 2500 转速度离心 20 分钟。 沉淀菌用 PBS 洗两次后，用 0.5%甲醛（用 PBS 配置）在室温中固定 3 小 时。置于 80℃水浴中 4 分钟以破坏菌体的自源性分解酶。再用 PBS 洗涤 2 次后配成 10%菌悬液