1.10蛋白质分离和纯化P2907章 (一)蛋白质分子量测定: (1)根据化学组成测最低分子量: 1.肌红蛋白、血红蛋白均含铁0.335%,分别求它们的最低分子量: 肌红蛋白为558(Fe原子量)÷0.335×100=16700,与其他方法测分 子量相符。 血红蛋白含铁也是0.335%,最低分子量也为16700,但用其他方法测 分子量为68000,即每一个血红蛋白含有4个铁原子,由此计算更为准确 分子量为:16700×4=66800。 2.由氨基酸含量计算 如牛血清清蛋白含Trp0.58%,蛋白质最低分子量为35200:每一牛血 清蛋白含有2个Trp,所以分子量为70400,比其他方法测出的准(69000)。 (2)沉降系数和沉降系数单位: 蛋白质分子在溶液中受强大离心力作用时,蛋白质分子沉降,沉降速 度与蛋白质分子大小和密度、分子形状等有关,可用于测分子量 沉降系数:蛋白质颗粒在单位离心场的沉降速度是个定值,称为沉降 系数或沉降常数用s表示 s常用来近似描述生物大分子的大小,蛋白质、核酸、核糖体和病毒 的沉降系数介于1×101到200×103sec范围,见293表7-4。 为方便起见,把10sec作为一个单位,称为 svedberg(斯维得贝格) 单位或沉降系数单位,用S表示,如人的H沉降系数为4.46S,即为446 ×10-3sec。 (二)蛋白质胶体性质与蛋白质的沉淀: 蛋白质溶液属胶体系统,分散相质点大小1~-100nm。 蛋白质可用盐析,有机溶剂沉淀,生成重金属盐、加生物碱和某些酸类(如 三氯乙酸)进行沉淀;蛋白质加热变性也会沉淀 (三)蛋白质的分离纯化: (1)前处理:将蛋白质从动、植物或细菌的组织或细胞中以溶解状态释 放出来,并保持天然状态,不丢失生物活性,如用适当缓冲液提取蛋白质, 离心除去杂质 粗分离:将蛋白质提取液中所需要的蛋白分出,除去其他杂蛋白 核酸和多糖等。 1.等电点沉淀和pH控制: 等电点沉淀:改变蛋白质溶液pH,使蛋白质净电荷为零处于等电点, 相邻蛋白分子间无静电斥力,溶解度最低,蛋白保持天然构象聚集沉淀。 P305图7-10pH和离子强度对β-乳球蛋白溶解度的影响,等电点为 I52-53,溶解度最低 由于不同蛋白有不同等电点,也可将一些蛋白质混合物分开。 2.盐溶和盐析 盐析:当溶液中盐浓度增大,离子强度达一定数值时,蛋白质溶解度 下降并进一步析出 盐析蛋白保持天然构象,能再溶解。一般用硫酸铵盐析,硫酸铵在水 中溶解度高,且溶解度的温度系数较低。 盐溶:当加入低浓度中性盐时,蛋白质溶解度增加
1.10 蛋白质分离和纯化 P290 7 章 （一）蛋白质分子量测定： （1） 根据化学组成测最低分子量： 1. 肌红蛋白、血红蛋白均含铁 0.335%，分别求它们的最低分子量： 肌红蛋白为 55.8（Fe 原子量）÷0.335×100=16700，与其他方法测分 子量相符。 血红蛋白含铁也是 0.335%，最低分子量也为 16700，但用其他方法测 分子量为 68000，即每一个血红蛋白含有 4 个铁原子，由此计算更为准确 分子量为：16700×4=66800。 2. 由氨基酸含量计算： 如牛血清清蛋白含 Trp0.58%，蛋白质最低分子量为 35200；每一牛血 清蛋白含有 2 个 Trp，所以分子量为 70400，比其他方法测出的准（69000）。 （2） 沉降系数和沉降系数单位： 蛋白质分子在溶液中受强大离心力作用时，蛋白质分子沉降，沉降速 度与蛋白质分子大小和密度、分子形状等有关，可用于测分子量。 沉降系数：蛋白质颗粒在单位离心场的沉降速度是个定值，称为沉降 系数或沉降常数用 s 表示。 s 常用来近似描述生物大分子的大小，蛋白质、核酸、核糖体和病毒 的沉降系数介于 1×10-13到 200×10-13 sec 范围，见 293 表 7-4。 为方便起见，把 10-13 sec 作为一个单位,称为 svedberg（斯维得贝格） 单位或沉降系数单位，用 S 表示，如人的 Hb 沉降系数为 4.46S，即为 4.46 ×10-13 sec。 （二）蛋白质胶体性质与蛋白质的沉淀： 蛋白质溶液属胶体系统，分散相质点大小 1~100nm。 蛋白质可用盐析，有机溶剂沉淀，生成重金属盐、加生物碱和某些酸类（如 三氯乙酸）进行沉淀；蛋白质加热变性也会沉淀。 （三）蛋白质的分离纯化： （1） 前处理：将蛋白质从动、植物或细菌的组织或细胞中以溶解状态释 放出来，并保持天然状态，不丢失生物活性，如用适当缓冲液提取蛋白质， 离心除去杂质。 （2） 粗分离：将蛋白质提取液中所需要的蛋白分出，除去其他杂蛋白、 核酸和多糖等。 1. 等电点沉淀和 pH 控制： 等电点沉淀：改变蛋白质溶液 pH，使蛋白质净电荷为零处于等电点， 相邻蛋白分子间无静电斥力，溶解度最低，蛋白保持天然构象聚集沉淀。 P305 图 7-10 pH 和离子强度对β-乳球蛋白溶解度的影响，等电点为 pH5.2~5.3，溶解度最低。 由于不同蛋白有不同等电点，也可将一些蛋白质混合物分开。 2. 盐溶和盐析： 盐析：当溶液中盐浓度增大，离子强度达一定数值时，蛋白质溶解度 下降并进一步析出。 盐析蛋白保持天然构象，能再溶解。一般用硫酸铵盐析，硫酸铵在水 中溶解度高，且溶解度的温度系数较低。 盐溶：当加入低浓度中性盐时，蛋白质溶解度增加
(3)细分级分离: 般用层析法和电泳法。 1.电泳:在外电场作用下,不处于等电状态的带电颗粒(如蛋白质分子) 将向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。 电泳迁移率或泳动度(μ):为单位电场强度下,蛋白质分子在溶液 中的移动速度 υ:颗粒泳动速度,E:电场强度 常用的电泳种类: 区带电泳:在支持物上电泳时,蛋白质混合物被分离成若干区带 ②薄膜电泳:使用醋酸纤维薄膜和聚酰胺薄膜。 ⑧凝胶电泳:凝胶有分子筛效应,可更好分离。如常用的聚丙烯酰胺 凝胶电泳(PAGE) ④毛细管电泳(HPCE):毛细管散热好,有助于消除热引起的对流和 区带变宽;系统髙分辨力,进样量少,可分离手性化合物。 ⑤等电聚焦电泳:具有不同等电点的两性电解质载体在电场中自动形 成pH梯度,使被分离物移动至各自等电点的pH处,聚集成很窄的区带。 分辨率高,适于分离分子量相同而电荷不同的两性分子 pH梯度制作:可利用两性电解质,已有商品出售 2.亲和层析:是利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法,可一步 提纯 根据生物分子与特定固相化配体( Ligand)之间的亲和力不同,而使 生物分子在一种特制的具有专一吸附能力的吸附剂上进行层析 例如将酶的底物或抑制剂接到固体支持物上(如琼脂糖),制成专 吸附剂,并装在层析柱中。当含有这种酶的溶液通过层析柱时,酶就会被 吸附,而其他蛋白质则不被吸附先流出:然后再用适当缓冲液将吸附在柱 上的酶洗脱下来。 (4)结晶: 结晶为蛋白质纯度一个标志,也是判断制品处于天然状态指标。蛋白 质纯,则易结晶,为分离提纯最后步骤
（3） 细分级分离： 一般用层析法和电泳法。 1. 电泳：在外电场作用下，不处于等电状态的带电颗粒（如蛋白质分子） 将向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。 电泳迁移率或泳动度（μ）：为单位电场强度下，蛋白质分子在溶液 中的移动速度。 μ = υ/E υ：颗粒泳动速度，E：电场强度 常用的电泳种类： ① 区带电泳：在支持物上电泳时，蛋白质混合物被分离成若干区带。 ② 薄膜电泳：使用醋酸纤维薄膜和聚酰胺薄膜。 ③ 凝胶电泳：凝胶有分子筛效应，可更好分离。如常用的聚丙烯酰胺 凝胶电泳（PAGE）。 ④ 毛细管电泳（HPCE）：毛细管散热好，有助于消除热引起的对流和 区带变宽；系统高分辨力，进样量少，可分离手性化合物。 ⑤ 等电聚焦电泳：具有不同等电点的两性电解质载体在电场中自动形 成 pH 梯度，使被分离物移动至各自等电点的 pH 处，聚集成很窄的区带。 分辨率高，适于分离分子量相同而电荷不同的两性分子。 pH 梯度制作：可利用两性电解质，已有商品出售。 2. 亲和层析：是利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法，可一步 提纯。 根据生物分子与特定固相化配体（Ligand）之间的亲和力不同，而使 生物分子在一种特制的具有专一吸附能力的吸附剂上进行层析。 例如将酶的底物或抑制剂接到固体支持物上（如琼脂糖），制成专一 吸附剂，并装在层析柱中。当含有这种酶的溶液通过层析柱时，酶就会被 吸附，而其他蛋白质则不被吸附先流出；然后再用适当缓冲液将吸附在柱 上的酶洗脱下来。 （4） 结晶： 结晶为蛋白质纯度一个标志，也是判断制品处于天然状态指标。蛋白 质纯，则易结晶，为分离提纯最后步骤