实验4点突变PCR 点突变PCR的使用机会越来越多了起来。当研究发现 中医药对某些特定基因的具有调整作用以后，自然要求深 入了解实现对该基因调整的具体途径，比如中医药对某基 因的调整是直接的，并通过这样的调整发挥疗效，抑或是 间接的；如果这些基因的功能尚不清楚，那么，哪些部位 是主要的功能区，改变了这些功能区会如何；在这些基因 中中医药可能对启动子的哪些部位发生作用，等等，点突 变PCR技术可以为回答这些疑问提供方便
本方法是利用PC技术，改变目的基因的个别或若干 碱基，使该碱基所处位置的基因功能发生变化，以观察其 意义。例如对于功能基因，可以检测点突变后功能是否发 生变化，以逐步明确功能区的意义；或直接破坏一些已明 确的功能区，使该基因失去原有功能；或用于筛选启动子 中的重要序列、增强子的位置，了解一些已知转录调控蛋 白及其特定结合序列的关系，等等。 点突变PCR技术的实现主要有两种方法，一种是比较 老的办法，叫做两步法点突变PCR;另一种发展比较晚， 并得益于Taq酶性能的提高，称之为一步法点突变PCR。 如STRATAGENE公司QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit所采用的一步法点突变PCR
原理 采用性能优良的DNA聚合酶PfuTurbo DNA polymerase,设计出含有突变位点的一对对应的引物，将含 有目的基因的载体加热解链，退火时，突变引物会结合到 载体插入片段的相应序列上，并以此作为引物，延伸。该 方法可以直接完成数千bp长度的含有插入片段的整个载 体的复制，使复制的DNA含有突变位点。PCR后，PCR 产物用DpnI消化原先的模版，这是因为大多来自于大肠 杆菌的DNA是甲基化的，对DpnI敏感，而新延伸的DNA 链则不然。消化后，所消化的质粒未突变链含有大量的切 口，在转化大肠杆菌后，大肠杆菌会依据突变链将切口修 补完善，并予以复制。从而完成基因的点突变。由于该技 术仅使用一次PCR循环，所以被称为一步法点突变PCR
Mix 0 Cyele Digest 3 Transform
实验5DNA双脱氧链终止法测序 目的 1.了解目的DNA的序列，如获得的DDPCR片段。 2.了解目的基因是否发生了突变、缺失。例如经中医 药治疗或处理后是否可以阻止或纠正病变组织基因组的突 变。 3.一些实验如Footprint要求在足迹电泳的一侧有 DNA的序列，以明确核蛋白所结合启动子的区域。 鉴定某一基因是否为目的基因。 测序有一些不同的方法及其改良法，比如化学降解测 序法，九十年代还发展起来多种自动测序仪，并不断升级 换代，给大量的测序工作提供了快捷、便利的条件。若测 序工作量不大，或没有自动测序仪，可以采用本实验介绍 的方法