(3)碱抽提法提取质粒DNA的步骤 第一步:溶菌 使用“溶液Ⅰ溶解细菌细胞壁。 Solution的配制: 50mM葡萄糖, 25mM Tris-HCl(pH8.0) 10mM EDTA 4-5mgm溶菌酶, RNase A 一次配置100m,灭菌后4度保存
（3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤 Solution I 的配制： 使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。 第一步：溶菌 50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl(pH8.0)， 10mM EDTA， 4-5mg/ml溶菌酶， RNase A 一次配置100ml，灭菌后4度保存
第二步:破膜,蛋白质和DNA变性 溶液Ⅱ破坏细胞膜,蛋白质和DNA变性。 Solution‖的配制(现用现配,室温使用): 0.2N NaOH, 1.0%SDS 第三步:中和 溶液Ⅲ使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物 和染色体DNA、RNA沉淀。 SolutionⅢ的配制 3M乙酸钾(用冰乙酸调pH至48)
溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。 第二步：破膜，蛋白质和DNA变性 Solution II 的配制(现用现配，室温使用)： 第三步：中和 溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物 和染色体DNA、RNA沉淀。 Solution III的配制： 0.2N NaOH，1.0%SDS 3M 乙酸钾（用冰乙酸调pH至4.8）
第四步:离心除去沉淀 上清液中含有闭合质粒DNA。 第五步:纯化DNA 上清液过柱或酚-氯仿抽提 第六步:沉淀DNA coom 0.6倍体积的异丙醇或2倍 体积的乙醇
上清液中含有闭合质粒DNA。 第四步：离心除去沉淀 0.6倍体积的异丙醇或2倍 体积的乙醇。 第五步：纯化DNA 上清液过柱或酚-氯仿抽提。 第六步：沉淀DNA
2.TESS法小管提取质粒DNA TESS溶液的配制 1 M TriS-CI(pH 8.0) 0.5 M EDTA(pH 8.0) ..0.2m 2N NaOH 5 ml 10% SDS 5 ml 加ddH2O定容至100ml
TESS溶液的配制 1 M Tris-Cl（pH 8.0）……………………1 ml 0.5 M EDTA（pH 8.0）………………0.2 ml 2 N NaOH…………………………………5 ml 10% SDS…………………………………5 ml 加ddH2O定容至100 ml。 2 .TESS法小管提取质粒DNA
2.TESS法小管提取质粒DNA 步骤 ①挑取单菌落于20m液体LB(Ant)培养基上, 37℃C,200rpm振荡培养14~16h; ②收集样品至15m的 Eppendorf管中,12000rpm离 心30s,弃上清,可重复2~3次; ③去上清,留下约100μ菌液,剧烈振荡重悬细胞; ④加入300山TESS溶液,轻轻颠倒混匀,室温放置5 min使之澄清;
步骤 ① 挑取单菌落于20 ml液体LB（Anti+）培养基上， 37℃，200 rpm振荡培养14~16 h； ② 收集样品至1.5 ml的Eppendorf管中，12 000 rpm离 心30 s，弃上清，可重复2~3次； ③ 去上清，留下约100 l菌液，剧烈振荡重悬细胞； ④ 加入300 l TESS溶液，轻轻颠倒混匀，室温放置5 min使之澄清； 2 .TESS法小管提取质粒DNA