人工粘性末端的连接平头末端 5" 3 G 3 C G TdT dTTP TdT dATP GTTTTTTTTTT 3 G CAAAAAAAAAA 3 3 TTTTTTTTTTG 3 AAAAAAAAAAC G 退火 T4-DNA ligase 5 AAAAAAAAAAC CAAAAAAAAAAC TTTG 5 5 AAAAAAAAAAC CAAAAAAAAAAC 5 加热 T 2777 GT G CA AAAzAAAC TG AC
人工粘性末端的连接 平头末端 C 3' G 5' G 3' G C 5' C 3' G T4-DNA ligase TdT dTTP TdT dATP GTTTTTTTTTT 3' C 退火 C 3' TTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAA 3' G G 3' AAAAAAAAAAC 5' 5' GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG S1 3' C 5' 5' GTTTTTTTTTTG CAAAAAAAAAAC CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG 加热 GT CA TTTTTTTTTG AAAAAAAAAC CA GT AAAAAAAAAC TTTTTTTTTG TG AC CA GT
粘性末端的更换 GGATCC CCTAGG BamHI 5" G 5 GATCC CCTAG 5 G Klenow 补平 5" GGATC 5 GATCC CCTAG 5 CTAGG T4-DNA ligase GGAATTCC EcoR I linker CCTTAAGG EcoR I 5" GGATCGGAATTCCGATCC CCTAGCCTTAAGGCTAGG
粘性末端的更换 BamHI 5' 5' GGATCC CCTAGG T4-DNA ligase Klenow 补平 5' GATCC 5' G G CCTAG 5' 5' 5' GGATC CCTAG 5' GATCC CTAGG 5' 5' GGATCGGAATTCCGATCC CCTAGCCTTAAGGCTAGG 5' 5' EcoR I GGAATTCC CCTTAAGG EcoR I linker
重组率 重组率的定义 重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数 在常规实验条件下,重组率一般为25-75% 重组率是衡量连接反应效率的重要指标,较高的重组率可以 大大简化DNA重组的后续操作
重组率 重组率的定义 重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75% 重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以 大大简化DNA重组的后续操作
重组率 提高重组率的方法 提高外源DNA片段与载体的分子比:5:1-10:1 载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团: 5 GAATTC GAATTC CTTAAG CTTAAG 碱性磷酸单酯酶 EcoRI 碱性磷酸单酯酶 G 5 p AATTC G 5 HO AATTC CTTAA OH 5 G CTTAA P 5 G 退火 HO OH G-A-A-T-T-C G A-A-T-T-C C-T-T-A-A G C-T-T-A-A-G HO OH
重组率 提高重组率的方法 提高外源DNA片段与载体的分子比：5 : 1 - 10 : 1 载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团： 5' 5' GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI 5' G CTTAA p AATTC G 5' G 5' p CTTAA OH 5' 5' AATTC G 5' HO 退火 5' G-A-A-T-T-C C-T-T-A-A G 5' G A-A-T-T-C C-T-T-A-A-G HO OH HO OH 碱性磷酸单酯酶 碱性磷酸单酯酶
重组率 提高重组率的方法 加装同聚尾末端: 5" GCATG 3 G CTGCA 3 3 GTACG 3ACGTC G TdT dCTP TdT GCATGCCCCCC 3 G CTGCAGGGGGG 3 3 CCCCCCGTACG 3 GGGGGGACGTC G 退火 5 GCATGCCCCCC CTGCAGGGGGG C GGGGGGACGTC G CCCCCCGTACG Kle T4-DNA ligase 5" GCATGCCCCCCTGCAG CGCAGGGGGGCATGO CGTACGGGGGGACGTC GACGTCCCCCCGTACG
重组率 提高重组率的方法 加装同聚尾末端： CTGCA 3' G G 3' ACGTC 5' GCATG 3' C 5' C 3' GTACG T4-DNA ligase TdT dCTP TdT dGTP GCATGCCCCCC 3' C 退火 C 3' CCCCCCGTACG CTGCAGGGGGG 3' G G 3' GGGGGGACGTC 5' 5' GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG 5' 5' GCATGCCCCCCTGCAG CGTACGGGGGGACGTC CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG Klenow