分选信号研究细胞的分泌途径的技术(1)早期研究用的是脉冲追踪标记与放射自显影(Pulse-chaselabellingandautoradiography；）（代表人物DeDuve.AClaudeandG.Palade.1974NobelPrize.；研究蛋白质合成、转运的动态过程，用氛标记的亮标记20分钟，再用氨酸作为蛋白质合成的前体之一，然后放入细胞培养基中，培养的是胰腺细胞，不带标记的培养基洗细胞，然后再放入正常培养基中培养，研究其插入部分的轨迹，然后在不同时间点3分钟，20分钟，120分钟取材，做超薄切片，用X光底片曝光，进行放射自显影，发现其最先出现在内质网，然后到高尔基体，最后进入分泌泡；说明蛋白质合成的起始位点是在糙面内质网上，转移过程加工是在高尔基体，然后进入分泌泡后，分泌泡作为储存颗粒可能再分泌到细胞外）UA20min120min3min(b)(c)(d)(2)VSVG-GFP转运途径（TransportofVSVG-GFPthroughthesecretorypathway）
5 分选信号 研究细胞的分泌途径的技术 ⑴早期研究用的是脉冲追踪标记与放射自显影(Pulse-chase labelling and autoradiography; )（代表人物 De Duve.A Claude and G. Palade.1974 Nobel Prize.；研究蛋白质合成、转运的动态过程，用氚标记的亮 氨酸作为蛋白质合成的前体之一，然后放入细胞培养基中，培养的是胰腺细胞，标记 20 分钟，再用 不带标记的培养基洗细胞，然后再放入正常培养基中培养，研究其插入部分的轨迹，然后在不同时间 点 3 分钟，20 分钟，120 分钟取材，做超薄切片，用 X 光底片曝光，进行放射自显影，发现其最先出 现在内质网，然后到高尔基体，最后进入分泌泡；说明蛋白质合成的起始位点是在糙面内质网上，转 移过程加工是在高尔基体，然后进入分泌泡后，分泌泡作为储存颗粒可能再分泌到细胞外) ⑵ VSVG-GFP 转运途径（Transport of VSVG-GFP through the secretory pathway）
O min40 min180 minERGolgiPlasmamembrane( GFPlabeledVSV-G(vesicularstomatitisvirusglycoprotein泡状炎病毒糖蛋白：Microscopyinlivingcells）（将病毒或与GFP融合基因转染细胞，病毒利用宿主细胞的机器合成病毒的蛋白，病毒蛋白特定性地转移到细胞膜上，用荧光显微镜观察其动态变化；）(3)组分特异性的寡糖修饰检测技术(Detectionofcompartment-specificoligosaccharidemodifications)有些蛋白质分子在转运过程中会存在些组分特异性的寡糖修饰，变成糖蛋白，在修饰过程中可能既涉及到内质网又涉及到高尔基体，完成一个糖蛋白的寡糖链的形成，这个过程是可以用来检测的。内切糖售剪口一抗性与敏感性比较C.J.Beckersetal:Cell50.523(1987)（内质网合成的糖蛋白带上一个基础核心糖链，红色的是2个N-乙酰葡糖胺，连到天门冬氨酸，圆圈是甘露糖，然后3个甘露糖被切除（在进入高尔基体的顺面膜囊时被切），糖的组成发生了变化，然后将糖蛋白从细胞匀浆里提取出来，其在内质网的组成是8个甘露糖，2个N-乙酰葡糖胺，在高尔基体的顺面膜囊区的组成是，5个甘露糖，2个N-乙酰葡糖胺；还涉及到一个酶，endoglycosidase内切糖苷酶D，左图是抗性的不被切掉，右图被切掉，可据此判断糖基化发生在什么地方：）（温度敏感性突变株，是mutant做的，现在在酵母里发现了很多，在32度是一个允许温度，到40度就产生功能缺失：因此可利用酵母细胞的突变体（单突变、双突变）来研究这个过程，知道哪一步发生了什么反应）(4)用酵母突变体来确认在膜泡转运过程当中它的阶段和组分的变化(Yeastmutantsdefinemajorstagesandmanycomponents invesiculartransport(temperature-sensitivesecretionmutants))现在根据酵母细胞突变体研究蛋白质的合成、转运以及以膜泡的形式在里面合成蛋白作分选的时候，它分了哪些阶段，涉及到哪些变化，找到了5种类型的突变体，有的可能是单突变，有的可能是多突变，都是温度敏感型突变：酵母是真核细胞，它在允许温度和非允许温度下功能是不一样的6
6 （ GFP labeled VSV-G(vesicular stomatitis virus glycoprotein 泡状口炎病毒糖蛋白；Microscopy in living cells) (将病毒或与 GFP 融合基因转染细胞，病毒利用宿主细胞的机器合成病毒的蛋白，病毒蛋白特定性地 转移到细胞膜上，用荧光显微镜观察其动态变化；) ⑶组分特异性的寡糖修饰检测技术(Detection of compartment-specific oligosaccharide modifications) 有些蛋白质分子在转运过程中会存在一些组分特异性的寡糖修饰，变成糖蛋白，在修饰过程中可 能既涉及到内质网又涉及到高尔基体，完成一个糖蛋白的寡糖链的形成，这个过程是可以用来检测的。 （内质网合成的糖蛋白带上一个基础核心糖链，红色的是 2 个 N-乙酰葡糖胺，连到天门冬氨酸，圆圈 是甘露糖，然后 3 个甘露糖被切除（在进入高尔基体的顺面膜囊时被切），糖的组成发生了变化，然 后将糖蛋白从细胞匀浆里提取出来，其在内质网的组成是 8 个甘露糖，2 个 N-乙酰葡糖胺，在高尔基 体的顺面膜囊区的组成是，5 个甘露糖，2 个 N-乙酰葡糖胺；还涉及到一个酶，endoglycosidase 内切 糖苷酶 D，左图是抗性的不被切掉，右图被切掉，可据此判断糖基化发生在什么地方；） （温度敏感性突变株，是 mutant 做的，现在在酵母里发现了很多，在 32 度是一个允许温度，到 40 度 就产生功能缺失；因此可利用酵母细胞的突变体（单突变、双突变）来研究这个过程，知道哪一步发 生了什么反应）。 ⑷用酵母突变体来确认在膜泡转运过程当中它的阶段和组分的变化(Yeast mutants define major stages and many components in vesicular transport(temperature-sensitive secretion mutants)) 现在根据酵母细胞突变体研究蛋白质的合成、转运以及以膜泡的形式在里面合成蛋白作分选的时 候，它分了哪些阶段，涉及到哪些变化，找到了 5 种类型的突变体，有的可能是单突变，有的可能是 多突变，都是温度敏感型突变；酵母是真核细胞，它在允许温度和非允许温度下功能是不一样的；