)冷冻真空干燥保藏法 将牛奶煮沸后冷却,去掉上面的一层脂肪。反复三次后用脱脂棉过滤, 或者将牛奶在3000mn的离心机中离心数分钟,除去表面脂肪后,在50kPa压 力下灭菌30min。然后用牛奶洗下在斜面上长好的菌体,制成菌悬液,装入安瓿 管中约0.1m,塞上棉塞,用橡皮管将安瓿管连接在分支管上(见图1-1) 分支管再与麦氏真空计和冷凝管相 连。冷凝管的另一端连接在真空泵 置冷凝管于盛有干冰(固体CO 的广口保温瓶中,使安瓿管中插出 的水汽进入冷凝管内立刻冻结。 将安瓿管的下半部也埋入干冰中 质骤然冷却。约10min,管 内物质已全部 开动真空泵 3min后,将安瓿管移入-15℃的冰 盐水中,继续开动真空泵抽气1h 然后将安瓿管置于室温中,再抽气 30min 图1-1冷冻干燥封管装置简图 、安瓿管2、干冰容器3、接真 此时管内暂质舍部干燥,样品呈空计4、接真空泵6、冷凝管 的 冷冻菌种管置于4℃C冰箱中保藏。 LOGO
LOGO （三）冷冻真空干燥保藏法 ▪ 分支管再与麦氏真空计和冷凝管相 连。冷凝管的另一端连接在真空泵 上。 ▪ 置冷凝管于盛有干冰（固体CO2） 的广口保温瓶中，使安瓿管中抽出 的水汽进入冷凝管内立刻冻结。 ▪ 将安瓿管的下半部也埋入干冰中， 使管内物质骤然冷却。约10min，管 内物质已全部冻结，开动真空泵 30min后，将安瓿管移入-15℃的冰 盐水中，继续开动真空泵抽气1h， 然后将安瓿管置于室温中，再抽气 30min。 ▪ 此时管内物质已全部干燥，样品呈 疏松状。用微型煤气灯在真空状态 下，熔封安瓿管的颈部。将制好的 冷冻菌种管置于4℃冰箱中保藏。 先将牛奶煮沸后冷却，去掉上面的一层脂肪。反复三次后用脱脂棉过滤， 或者将牛奶在3000r/min的离心机中离心数分钟，除去表面脂肪后，在50kPa压 力下灭菌30min。然后用牛奶洗下在斜面上长好的菌体，制成菌悬液，装入安瓿 管中约0.1ml，塞上棉塞，用橡皮管将安瓿管连接在分支管上（见图1-1） 图1-1 冷冻干燥封管装置简图 1、安瓿管 2、干冰容器 3、接真 空计 4、接真空泵 5、冷凝管
(四)试管熔封(密封)保藏法 试管熔封法的一般操作如下: ■用各种琼脂斜面(普通肉汤等)常规灭菌后,经接种,室温培养24 48小时后,将接种菌生长旺盛的试管用喷灯将其管口熔封,分别置室 温和冰箱下保存 ■使用时,用砂轮在管口划一圈,并在乙醇灯下火焰灭菌后敲开管口即 可转接到另一斜面上,由于试管经熔封后,可防止培养基水分蒸发, 又可减缓细菌的代谢速度,并能防止杂菌污染 密封法保藏法 ■将需保藏菌种按无菌操作要求接种至固体培养基(细菌采用肉汤琼脂、 酵母采用蔡氏培养基、放线菌采用高氏1号培养基 适温培养 后,(细菌1~2d,孢芽菌、放线菌5~7d,酵母菌3d)塞紧棉 花塞,放在干燥器内,干燥器密封处涂上凡士林。盖紧后使之与真空 泵相连接,开动真空泵抽真空30rain至1h(此时真空度约为640) 关闭密封口,拔出胶塞,置于室温下保存,待使用时,打开盖,取出 菌种,接种至培养基上即可。 LOGO
LOGO （四）试管熔封（密封）保藏法 ▪ 试管熔封法的一般操作如下： ▪ 用各种琼脂斜面（普通肉汤等）常规灭菌后，经接种，室温培养24～ 48小时后，将接种菌生长旺盛的试管用喷灯将其管口熔封，分别置室 温和冰箱下保存。 ▪ 使用时，用砂轮在管口划一圈，并在乙醇灯下火焰灭菌后敲开管口即 可转接到另一斜面上，由于试管经熔封后，可防止培养基水分蒸发， 又可减缓细菌的代谢速度，并能防止杂菌污染。 ▪ 密封法保藏法 ▪ 将需保藏菌种按无菌操作要求接种至固体培养基（细菌采用肉汤琼脂、 酵母采用蔡氏培养基、放线菌采用高氏１号培养基）上，经适温培养 后，（细菌１～２d，孢芽菌、放线菌５～７d，酵母菌３d）塞紧棉 花塞，放在干燥器内，干燥器密封处涂上凡士林。盖紧后使之与真空 泵相连接，开动真空泵抽真空30rain至１h（此时真空度约为640）， 关闭密封口，拔出胶塞，置于室温下保存，待使用时，打开盖，取出 菌种，接种至培养基上即可
(五)矿油保存法 菌种在琼脂斜面上或在半固体琼脂试管中生长后 在试管中再加入无菌液体石蜡,使覆盖在培养基 上面,这样就使菌种和培养基与外界空气隔绝, 并可防止培养基水分蒸发,管口可用固体石蜡封 口,放置低温保存,至少可以保存六个月至 年)。 LOGO
LOGO （五）矿油保存法 ▪ 菌种在琼脂斜面上或在半固体琼脂试管中生长后， 在试管中再加入无菌液体石蜡，使覆盖在培养基 上面，这样就使菌种和培养基与外界空气隔绝， 并可防止培养基水分蒸发，管口可用固体石蜡封 口，放置低温保存，至少可以保存六个月至一 年）
表11菌种保藏各种方法比较表 保戴方法。基本原理里通围。保戴期 特 斜面保藏法。低温 微生物。3~6月。简便、时短、 除病毒外的各类 易污染退化 低温、干燥与缺芽孢杆菌、霉菌 简便、时间、 沙土保藏法 1~10年 乏营养。和放线菌等 易退化变异 冷冻真空干燥保低温、干燥与缺 各类微生物 5~15年。长时间高效、技 藏法 氧 术要求高 低温、缺乏营养 简便、时j长、 试封保藏法 与隔绝空气 细菌、酵母菌等2~3年 不易污染 矿油保存法。低温、缺氧细菌、酵母菌、6个月~2年。简便、时间短 霉菌等 LOGO
LOGO 表1-1 菌种保藏各种方法比较表
表12微生物菌种制备、保藏和使用记录表 、菌种名称 ATcC(或CMCC)No. 菌种来源 实验室编号 传代代数 2、菌种制备 培养基 批号 接种日期 接种容器 数量 培养条件 温度 时间 纯化分离鉴定结果操作人员 日期 3、菌种保藏 菌种保藏方法保藏数量保藏培养基批号 培养条件培养温度 培养时间 表1-2菌种使用记录表 匚序号。使用日期叫。数量。使用者用途。处理。备注2 143 ++ +++++ 74 当菌种超过有效期或被污染以后应灭菌丢弃是否 说明:实验室菌种编号原则为名称+传代次数+制备日期,例E.col-3-200905084
LOGO 表1-2微生物菌种制备、保藏和使用记录表