兽医微生物学实验讲义授课老师：刘广锦liugi100@niau.edu.cn.课前准备：1．兽医微生物学实验注意事项实验时必须注意安全，防止人身和设备事故的发生穿实验服，不准在实验室内饮食未经允许不要接触仪器、培养物、试剂、动物等，不得将实验室物品带出实验室实验完毕，应清理实验场地，并将仪器、工具等放还原位，实验后独立完成实验报告，不得抄袭或臆造。在下次上课前上交实验报告。2．实验报告格式实验目的实验原理实验材料实验步骤注意事项实验结果及分析课后思考显微镜的构造和使用及细菌形态结构的观察实验一一、主要内容1.普通光学显微镜的基本结构2.几种显微镜的简单原理3.光学显微镜的观察方式4.油镜的原理和使用5.使用完毕显微镜及标本片的处理6. 玻片观察二、作业1、普通显微镜与油镜使用上有何区别？2、绘出你所观察到的3 种不同细菌形态（G/G)。三、实验原理什么是显微镜？为什么要用显微镜观察？人眼只能看到 0.2mm以上的物体细菌仅有0.2-20um，病毒更小，17-300nm光学显微镜结构光学显微镜的分类正置显微镜倒置显微镜体视显微镜光学显微镜七种观察方式四、实验步骤油镜的使用1. 识别
兽医微生物学实验讲义 授课老师：刘广锦 liugj100@njau.edu.cn、 课前准备： 1. 兽医微生物学实验注意事项 实验时必须注意安全，防止人身和设备事故的发生； 穿实验服，不准在实验室内饮食； 未经允许不要接触仪器、培养物、试剂、动物等，不得将实验室物品带出实验室； 实验完毕，应清理实验场地，并将仪器、工具等放还原位； 实验后独立完成实验报告，不得抄袭或臆造。在下次上课前上交实验报告。 2. 实验报告格式 实验目的 实验原理 实验材料 实验步骤 注意事项 实验结果及分析 课后思考 实验一 显微镜的构造和使用及细菌形态结构的观察 一、主要内容 1. 普通光学显微镜的基本结构 2. 几种显微镜的简单原理 3. 光学显微镜的观察方式 4. 油镜的原理和使用 5. 使用完毕显微镜及标本片的处理 6. 玻片观察 二、作业 1、普通显微镜与油镜使用上有何区别？ 2、绘出你所观察到的 3 种不同细菌形态（G +/G -）。 三、实验原理 什么是显微镜？ 为什么要用显微镜观察？ 人眼只能看到 0.2mm 以上的物体 细菌仅有 0.2-20μm，病毒更小，17-300nm， 光学显微镜结构 光学显微镜的分类 正置显微镜 倒置显微镜 体视显微镜 光学显微镜七种观察方式 四、实验步骤 油镜的使用 1. 识别：
油镜是一种放大倍数较高（95-100倍）的物镜一般刻有放大倍数（95，100×）或标记：Oil油镜的镜身最长，镜片最小2.原理：油镜头与载玻片之间放上，与玻璃的折光指数相近的油类，如香柏油等，光线不会因折射而损失太大，可使视野分明，清楚进行观察。3.油镜的使用方法A光圈调最大B.标本玻片上滴加香柏油0.5-1滴C.转换油镜头漫入油滴中,使其几乎与标本面接触为度D.双眼由目镜观察，慢慢转动粗准焦螺旋，使镜筒上提，模糊看到有物像时，转动细准焦螺旋至物像清晰4、使用完毕显微镜及标本片的处理油镜用过后，应立即用擦镜纸将镜头和玻片擦拭干净如油渍已干，须用擦镜纸蘸少许二甲苯溶液拭去油渍，再用干擦镜纸拭净镜头使用完毕显微镜，取下玻片，将物镜升到最高，光圈调最小，关闭电源，套上防尘罩，放回原处
油镜是一种放大倍数较高（95-100 倍）的物镜 一般刻有放大倍数（95×，100×）或标记：Oil 油镜的镜身最长，镜片最小 2. 原理： 油镜头与载玻片之间放上，与玻璃的折光指数相近的油类，如香柏油等，光线不会因折射而 损失太大，可使视野分明，清楚进行观察。 3. 油镜的使用方法 A. 光圈调最大 B. 标本玻片上滴加香柏油 0.5-1 滴 C. 转换油镜头浸入油滴中,使其几乎与标本面接触为度 D. 双眼由目镜观察，慢慢转动粗准焦螺旋，使镜筒上提 E. 模糊看到有物像时，转动细准焦螺旋至物像清晰 4. 使用完毕显微镜及标本片的处理 油镜用过后，应立即用擦镜纸将镜头和玻片擦拭干净 如油渍已干，须用擦镜纸蘸少许二甲苯溶液拭去油渍，再用干擦镜纸拭净镜头 使用完毕显微镜，取下玻片，将物镜升到最高，光圈调最小，关闭电源，套上防尘罩，放回 原处
实验二细菌的抹片制备及染色、目的要求1.掌握细菌抹片的制备方法和无菌操作技术2.掌握几种常用的染色方法和技术3.巩固显微镜的使用，了解细菌的染色特性、形态二、材料1、大肠杆菌与金黄色葡萄球菌：液体枯草芽孢杆菌：斜面（固体）2、革兰染色液，生理盐水3、载玻片、接种棒、酒精灯等三、制片及染色步骤取干净玻片-抹片-干燥-固定-染色-干燥镜检1. 玻片的处理玻片应清晰透明、洁净而无油渍旧玻片有油，可用95%酒精擦洗，然后在酒精灯上灼烧。2.细菌抹片的制备：根据所用材料不同，抹片的方法也有差异。(可用记号笔在玻片背面圈出涂抹区域)(1）固体培养物用经酒精灯火焰烧过的接种环，蘸取生理盐水1-2环于清洁无油脂的载玻片中央，再经酒精灯火焰烧过的接种环勾取细菌的固体培养物少许混于生理盐水中，涂抹成直径为 1-1.5cm大小圆，均匀的抹片。也可直接刮取菌落涂在玻片上(2）液体培养物可直接用酒精灯火焰烧过的接种环勾取细菌培养物1-2环，涂抹于玻片上即可。但要注意将管底沉淀物摇匀，以免影响涂片效果。涂抹后的接种环，酒精灯火焰烧过，充分灭菌。(3）组织涂片/触片用灭菌的剪刀、镊子取被检组织一小块，以其断面在玻片上压触或涂抹成适当大小的薄片。如为脓汁、血液、乳汁等可直接涂抹于玻片上注意：无论何种方法切忌涂片太厚，宜轻不宜重，画同心圆，不要破坏细菌的正常排列，否则不利于染色和观察3.干燥：上述抹片应自然充分干燥4.固定(1)目的:1)、除去抹片上的水分，使菌体蛋白附着在载玻片上，以防染色过程中被水冲掉2)、使抹片易于着色，变性的蛋白质着色力强。3)、杀死抹片中的微生物。(2）方法将已干燥的抹片菌膜面向上，以钟摆速度在酒精灯火焰上通过数次（以不1)、火焰固定烫手背为宜)。2)、化学固定：用于组织触片，血液推片，加数滴甲醇于玻片上，固定2-3分钟后自然干燥。四、常用的几种染色方法1、革兰氏染色法
实验二 细菌的抹片制备及染色 一、目的要求 1. 掌握细菌抹片的制备方法和无菌操作技术 2. 掌握几种常用的染色方法和技术 3. 巩固显微镜的使用，了解细菌的染色特性、形态 二、材料 1、大肠杆菌与金黄色葡萄球菌：液体 枯草芽孢杆菌：斜面（固体） 2、革兰染色液，生理盐水 3、载玻片、接种棒、酒精灯等 三、制片及染色步骤 取干净玻片-抹片-干燥-固定-染色-干燥镜检 1. 玻片的处理： 玻片应清晰透明、洁净而无油渍； 旧玻片有油，可用 95%酒精擦洗，然后在酒精灯上灼烧。 2. 细菌抹片的制备： 根据所用材料不同，抹片的方法也有差异。 (可用记号笔在玻片背面圈出涂抹区域) （1）固体培养物 用经酒精灯火焰烧过的接种环，蘸取生理盐水 1-2 环于清洁无油脂的载玻片 中央，再经酒精灯火焰烧过的接种环勾取细菌的固体培养物少许混于生理盐水中，涂抹成直 径为 1-1.5cm 大小圆，均匀的抹片。也可直接刮取菌落涂在玻片上 （2）液体培养物 可直接用酒精灯火焰烧过的接种环勾取细菌培养物 1-2 环，涂抹于玻片上即可。 但要注意将管底沉淀物摇匀，以免影响涂片效果。 涂抹后的接种环，酒精灯火焰烧过，充分灭菌。 （3）组织涂片/触片 用灭菌的剪刀、镊子取被检组织一小块，以其断面在玻片上压触或涂抹成适当大小的 薄片。如为脓汁、血液、乳汁等可直接涂抹于玻片上。 注意：无论何种方法切忌涂片太厚，宜轻不宜重，画同心圆，不要破坏细菌 的正常排列，否则不利于染色和观察。 3. 干燥： 上述抹片应自然充分干燥 4. 固定 （1）目的: 1)、除去抹片上的水分，使菌体蛋白附着在载玻片上，以防染色过程中被水冲掉。 2)、使抹片易于着色，变性的蛋白质着色力强。 3)、 杀死抹片中的微生物。 （2）方法： 1)、火焰固定： 将已干燥的抹片菌膜面向上，以钟摆速度在酒精灯火焰上通过数次（以不 烫手背为宜）。 2)、化学固定：用于组织触片，血液推片，加数滴甲醇于玻片上，固定 2-3 分钟后自然干燥。 四、常用的几种染色方法 1、革兰氏染色法
2、姬姆萨染色法3、瑞氏染色法4、美兰染色法未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察，染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。1.革兰氏染色是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，这种染色法是由一位丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰（Hans Christian Gram，1853年－1938年）于1884年发明。1.革兰氏染色法1.草酸铵结晶紫染色2min，水洗2.革兰氏碘液媒染 2 min，水洗3.95%酒精脱色约30s，水洗4.沙黄水溶液复染30s，水洗5.干燥，镜检3.姬姆萨染色法1。甲醇固定3min，时间长短均可2。姬姆萨液足量30min或数小时至24h，水洗3。吸干镜检4.瑞氏染色法1.抹片干燥无需固定，直接滴加染色液1-3min,2.再加等量中性蒸馏水，轻轻混匀，续染15 min,3.水洗，吸干镜检注意事项1、玻片要洁净无油，否则菌液涂不开2、涂片不宜太厚，涂布时宜轻不宜重3、保持无菌操作，EP管合盖前，管口消毒4、接种环使用前后一定要在火焰上，烧红铂耳，由前向后，彻底灼烧灭菌，挑菌前待接种环冷却后才用作业1。根据实验体会，你认为制备染色标本时应注意哪些事项？2。在你所做的革兰氏染色片中，大肠杆菌和链球菌各染成何色？它们是革兰阳性还是阴性菌?3。革兰氏染色的原理？
2、姬姆萨染色法 3、瑞氏染色法 4、美兰染色法 未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察 ，染色后细 菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类 鉴定。 1. 革兰氏染色法 是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，这种染色法是由一位丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革 兰（Hans Christian Gram，1853 年－1938 年）于 1884 年发明。 1. 革兰氏染色法 1. 草酸铵结晶紫染色 2 min，水洗 2. 革兰氏碘液媒染 2 min，水洗 3. 95%酒精脱色约 30 s，水洗 4. 沙黄水溶液复染 30 s，水洗 5. 干燥，镜检 3. 姬姆萨染色法 1。甲醇固定 3 min，时间长短均可 2。姬姆萨液足量 30 min 或数小时至 24h，水洗 3。吸干镜检 4. 瑞氏染色法 1. 抹片干燥无需固定，直接滴加染色液 1-3 min， 2. 再加等量中性蒸馏水，轻轻混匀，续染 15 min， 3. 水洗，吸干镜检 注意事项 1、玻片要洁净无油，否则菌液涂不开 2、涂片不宜太厚，涂布时宜轻不宜重 3、保持无菌操作，EP 管合盖前，管口消毒 4、接种环使用前后一定要在火焰上，烧红铂耳，由前向后，彻底灼烧灭菌，挑菌前待接种 环冷却后才用 作业 1。根据实验体会，你认为制备染色标本时应注意哪些事项？ 2。在你所做的革兰氏染色片中，大肠杆菌和链球菌各染成何色？它们是革兰阳性还是阴性 菌？ 3。革兰氏染色的原理？
实验三培养基的制备刘广锦目的要求：掌握基础培养基制备的原则和要求；2掌握一般培养基的制备过程及 pH 的测定培养基的种类及用途1、固体培养基：分离培养、、纯培养、保存菌种；（含1.5-2%琼脂2、半固体培养基：细菌运动力的检查；(含0.2-0.5%琼脂)3、液体培养基：观察细菌的生长状况、保存菌种，(不含琼脂)三、培养基制作的注意事项1、细菌生长所需的营养物质2、盛器不含抑菌物3、必须符合生长要求，弱碱性（pH7.2-7.6）4、要过滤，应为半透明或透明5、制好后需高压灭菌，后续试验必须保持无菌6、培养基中某些成分（血清、氨基酸、酶类等)，在高温下易分解、变性，应无菌过滤（0.2um滤膜）后按规定温度加入培养基中四、培养基制备的一般过程按量称取一溶解一调pH分装一灭菌一菌检LB液体培养基制备(Lysogeny broth)1、按量称取：蛋白陈（Tryptone）6克酵母提取物（yeast extract）3克NaCl 6克加去离子水500ml，充分溶解2、调pH用 1MNaOH边加边搅拌，不时用pH试纸测试；当pH接近7时，改用0.1MNaOH，直至pH值至7.4~7.63、加去离子水定容至600ml4、分装：每组10根试管，3ml/管，捆扎标记5、灭菌(121℃，20-30分钟）LB 固体培养基的制备固体斜面：测好pH后，用量筒取LB液体液体培养基 500ml，倒入锅中，称量10克琼脂（2%)；边加热边搅动（勿溢出），看一下水位，补足水分；待琼脂完全溶解后，每组分装10根长管8m/管；捆扎标记。剩余培养基装入广口瓶中，灭菌（121℃.20-30分钟）：趁热将试管口一端搁在玻棒上，倾斜放置，冷却凝固。LB固体培养基的制备LB平板：
实验三 培养基的制备 刘广锦 一、 目的要求： 1、 掌握基础培养基制备的原则和要求; 2、 掌握一般培养基的制备过程及 pH 的测定 二 培养基的种类及用途 1、固体培养基：分离培养、纯培养、保存菌种； (含 1.5-2%琼脂) 2、半固体培养基：细菌运动力的检查； (含 0.2-0.5%琼脂) 3、液体培养基：观察细菌的生长状况、保存菌种。 (不含琼脂) 三、培养基制作的注意事项 1、细菌生长所需的营养物质 2、盛器不含抑菌物 3、必须符合生长要求，弱碱性（pH7.2-7.6） 4、要过滤，应为半透明或透明 5、制好后需高压灭菌，后续试验必须保持无菌 6、培养基中某些成分（血清、氨基酸、酶类等），在高温下易分解、变性，应无菌过滤（0.22μm 滤膜）后按规定温度加入培养基中 四、培养基制备的一般过程 按量称取→溶解→调 pH→分装→灭菌→菌检 LB 液体培养基制备 (Lysogeny broth) 1、按量称取： 蛋白胨（Tryptone） 6 克 酵母提取物 （yeast extract）3 克 NaCl 6 克 加去离子水 500ml，充分溶解 2、调 pH： 用 1M NaOH 边加边搅拌，不时用 pH 试纸测试； 当 pH 接近 7 时，改用 0.1M NaOH，直至 pH 值至 7.4~7.6 3、加去离子水定容至 600ml 4、分装： 每组 10 根试管，3ml/管，捆扎标记 5、灭菌（121 ℃，20-30 分钟） LB 固体培养基的制备 固体斜面： 测好 pH 后，用量筒取 LB 液体液体培养基 500ml ，倒入锅中，称量 10 克琼脂（2%）；边加 热边搅动（勿溢出），看一下水位，补足水分；待琼脂完全溶解后，每组分装 10 根长管， 8ml/管；捆扎标记，剩余培养基装入广口瓶中，灭菌（121 ℃，20-30 分钟）；趁热将试管 口一端搁在玻棒上，倾斜放置，冷却凝固。 LB 固体培养基的制备 LB 平板：