第三节基因工程载体 o载体是指将外源DNA片段运送进宿主细胞进行扩增或表 达的运载工具 o克隆载体克隆了外源DNA后,转入宿主细胞中进行 繁殖,使克隆的DNA片段数量大大增加 o表达载体将外源基因或DNA片段在宿主细胞中表达 蛋白质 o插入型载体将外源基因或DNA插入其中 置换型载体切除载体部分DNA,代之以外源基因或 DNA
16 第三节 基因工程载体 ○ 载体是指将外源DNA片段运送进宿主细胞进行扩增或表 达的运载工具 ○ 克隆载体——克隆了外源DNA后，转入宿主细胞中进行 繁殖，使克隆的DNA片段数量大大增加 ○ 表达载体——将外源基因或DNA片段在宿主细胞中表达 蛋白质 ○ 插入型载体——将外源基因或DNA插入其中 ○ 置换型载体——切除载体部分DNA，代之以外源基因或 DNA
载体必须具备的条件 能在宿主细胞中大量复制,得到大量的重组 DNA分子 载体上的内切酶位点对于一种酶来说只能有 个(置换型载体上被置换片段的两侧各有一个 内切酶位点) 克隆载体要有复制起点,表达载体要有启动子 载体上要有报告基因或选择标记基因 在不影响载体复制和表达的DNA序列上有内切 酶酶切位点
17 载体必须具备的条件 · 能在宿主细胞中大量复制，得到大量的重组 DNA分子 · 载体上的内切酶位点对于一种酶来说只能有一 个（置换型载体上被置换片段的两侧各有一个 内切酶位点） · 克隆载体要有复制起点，表达载体要有启动子 · 载体上要有报告基因或选择标记基因 · 在不影响载体复制和表达的DNA序列上有内切 酶酶切位点
质粒载体 o质粒是一种存在于细菌细胞质中,独立于细 菌染色体而自然存在的,在细菌体内能进行自我 复制、易分离和导入的DNA环状双链分子 o质粒大小相差很大(从小于1Kb到大于 500Kb),都有一个复制起点。 o亲缘关系密切的两种质粒不能在同一宿主细 胞中稳定地共存,称为质粒的不亲和性。 o只能在特定宿主细胞中复制的称为窄宿主范 围质粒;可以在多种宿主细胞中复制的称为广宿 主范围质粒
18 一、质粒载体 ○ 质粒是一种存在于细菌细胞质中，独立于细 菌染色体而自然存在的，在细菌体内能进行自我 复制、易分离和导入的DNA环状双链分子 ○ 质粒大小相差很大（从小于1Kb到大于 500Kb），都有一个复制起点。 ○ 亲缘关系密切的两种质粒不能在同一宿主细 胞中稳定地共存，称为质粒的不亲和性。 ○ 只能在特定宿主细胞中复制的称为窄宿主范 围质粒；可以在多种宿主细胞中复制的称为广宿 主范围质粒
o严谨型质粒每个细胞中有1-2个拷贝,具有 自身传递能力,分子量大。 松弛型质粒每个细胞中有10-100个拷贝, 不具有自身传递能力,分子量小。基因工程常用 此类质粒。 o常用的质粒有:pBR322、Psc101、CoE1 Psc134等 o质粒载体一般能克隆10Kb左右的DNA片段
19 ○ 严谨型质粒——每个细胞中有1-2个拷贝，具有 自身传递能力，分子量大。 ○松弛型质粒——每个细胞中有10-100个拷贝， 不具有自身传递能力，分子量小。基因工程常用 此类质粒。 ○ 常用的质粒有：pBR322、Psc101、ColE1、 Psc134等。 ○ 质粒载体一般能克隆10Kb左右的DNA片段
第四节目的基因的获取 O利用PCR克隆目的基因 反向PCR〔 inverse Pcr,IPCR)克隆基因组DNA 片段 I-PCR是根据已知序列扩增其旁侧序列的方法。所用 的引物与正常的PCR引物方向相反 反转录 PCR(reverse transcription- PCR.RT-PCR)合 成cDNA RT-PCR是以mRNA为模板,在逆转录酶作用下合 成cDNA,再复制成双链DNA
20 第四节 目的基因的获取 ○ 利用PCR克隆目的基因 · 反向PCR（inverse PCR,I-PCR）克隆基因组DNA 片段 I-PCR是根据已知序列扩增其旁侧序列的方法。所用 的引物与正常的PCR引物方向相反 · 反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)合 成cDNA ·RT-PCR是以mRNA为模板，在逆转录酶作用下合 成cDNA，再复制成双链DNA