调制叶绿素荧光仪 Junior-PAN操作手册 泽泉科技有限公司,德国WALZ公司中国技术服务中心 22仪器的组装及软件安装 221 Junior-PAM组装 将光纤较粗的一端插到 Junior-PAM主机的光纤接口,轻轻的将光纤插到 底,锁紧。 将光纤另一端插到磁性叶夹,调节光纤末端到样品的距离为lm。 用USB线将 Junior-PAM主机和电脑(支持 Windows2000,XP或者 Vista)连 接好 Light guide socket socket 图2.2 Junior-PAM光纤接口 图2.3磁性叶夹 222安装 Win control-3软件 登录http://www.walz.com下载最新版WinControl-3,将软件放到英文目 录下,双击软件进行安装。(建议将软件安装到盘或者E盘等非系统分区) 安装完成后会在桌面上出现 WinContro1-3快捷方式 双击桌面上 WinControl-3的快捷方式启动软件,软件启动后自动搜索仪器 接口,搜索成功后直接进入主界面(未连接仪器时可以选择 Offline-Mode)
调制叶绿素荧光仪 Junior-PAM 操作手册 泽泉科技有限公司，德国 WALZ 公司中国技术服务中心 3 2.2 仪器的组装及软件安装 2.2.1 Junior-PAM 组装 ¾ 将光纤较粗的一端插到Junior-PAM主机的光纤接口，轻轻的将光纤插到 底，锁紧。 ¾ 将光纤另一端插到磁性叶夹，调节光纤末端到样品的距离为1mm。 ¾ 用USB线将Junior-PAM主机和电脑（支持Windows 2000, XP 或者 Vista）连 接好。 ¾ 图2.2 Junior-PAM光纤接口 图2.3 磁性叶夹 2.2.2 安装 WinControl-3 软件 ¾ 登录http://www.walz.com/ 下载最新版WinControl-3，将软件放到英文目 录下，双击软件进行安装。（建议将软件安装到D盘或者E盘等非系统分区） 安装完成后会在桌面上出现WinControl-3快捷方式。 ¾ 双击桌面上WinControl-3的快捷方式启动软件，软件启动后自动搜索仪器 接口，搜索成功后直接进入主界面（未连接仪器时可以选择 Offline-Mode）
调制叶绿素荧光仪 Junior-PAN操作手册 泽泉科技有限公司,德国WALZ公司中国技术服务中心 3PAM荧光测定技术和饱和脉冲分析 叶绿素分子吸收可见光光子后发生电子跃迁,电子跃迁到能量较高的激发 态。通常情况下处于激发态的电子不稳定,要放出能量回到基态。电子回到基 态时放出的能量用于:1)发射出红色荧光;2)放出热;3)用于光化学反应 三种途径彼此竞争,因此热耗散和光化 Fluorescence Excitation 学反应的变化都会引起荧光产量的变 chi Heat 化,当然入射光强的变化也会引起荧光 Photochemistry 的变化 在光合膜上,有2%到10%的吸收光能以PSII荧光的形式释放出来。而PSI发 射的荧光量很小并且是恒定的,这里没有进行考虑。从1931年 Kautsky和 Hirsch ( Naturwissenschaften19:964)观察到叶绿素荧光的产量变化和光合作用相关 开始,到接下来的50年中,快速、高灵敏度荧光仪的发明为阐明光合作用复杂的 机理起到了极大的推动作用 20世纪80年代中期,调制荧光仪专利技术(PAM)的发明大大促进了光合作 用的研究。从第一台调制荧光仪PAM-101到最新的便携式荧光仪(PAM 2100/2500)、水下荧光仪( Diving-PAM)及荧光成像系统( Imaging-PAMM Series)在世界各地都得到了广泛的应用。 和传统荧光仪不同的是,PAM荧光仪只记录由测量光激发的荧光,而对由其 它光照引起的荧光不进行记录。这就允许在存在环境光时对样品进行测定。 下面简短介绍调制荧光仪的荧光信号及饱和脉冲分析方法。 31调制荧光(脉冲一振幅一调制) 图3.1A描绘这么一个程序:存在脉冲光时分别照射两个不同强度的光化光 (每个持续80s)。通常情况下这个脉冲光的振幅和频率恒定且强度较低(不足 以引起光合作用),在PAM荧光仪中,这个脉冲光就是测量光
调制叶绿素荧光仪 Junior-PAM 操作手册 泽泉科技有限公司，德国 WALZ 公司中国技术服务中心 4 3 PAM 荧光测定技术和饱和脉冲分析 叶绿素分子吸收可见光光子后发生电子跃迁，电子跃迁到能量较高的激发 态。通常情况下处于激发态的电子不稳定，要放出能量回到基态。电子回到基 态时放出的能量用于：1）发射出红色荧光；2）放出热；3）用于光化学反应。 三种途径彼此竞争，因此热耗散和光化 学反应的变化都会引起荧光产量的变 化，当然入射光强的变化也会引起荧光 的变化。 在光合膜上，有2％到10%的吸收光能以PSII荧光的形式释放出来。而PSI发 射的荧光量很小并且是恒定的，这里没有进行考虑。从1931年Kautsky和Hirsch （Naturwissenschaften 19:964）观察到叶绿素荧光的产量变化和光合作用相关 开始，到接下来的50年中，快速、高灵敏度荧光仪的发明为阐明光合作用复杂的 机理起到了极大的推动作用。 20世纪80年代中期，调制荧光仪专利技术（PAM）的发明大大促进了光合作 用的研究。从第一台调制荧光仪PAM－101到最新的便携式荧光仪（PAM－ 2100/2500）、水下荧光仪（Diving－PAM）及荧光成像系统（Imaging－PAM M Series）在世界各地都得到了广泛的应用。 和传统荧光仪不同的是，PAM荧光仪只记录由测量光激发的荧光，而对由其 它光照引起的荧光不进行记录。这就允许在存在环境光时对样品进行测定。 下面简短介绍调制荧光仪的荧光信号及饱和脉冲分析方法。 3.1 调制荧光（脉冲－振幅－调制） 图3.1 A 描绘这么一个程序：存在脉冲光时分别照射两个不同强度的光化光 （每个持续80s）。通常情况下这个脉冲光的振幅和频率恒定且强度较低（不足 以引起光合作用），在PAM荧光仪中，这个脉冲光就是测量光
绿素荧光仪 Junior-PAN操作手册 泽泉科技有限公司,德国WALZ公司中国技术服务中心 3001 A: Excitation Intensity[ Puised 0,EaE58 continuous B: Conventional FIt tonometer u 8200 ua!I standard C: PAM Fluorometer 100 Time s 图3.1调整荧光仪(PAM)测量图解 如果用图3.1A的照光程序来照射 Junior-PAM的荧光标准而用传统荧光仪进 行记录时就会得到图3.1B中标注了" standard"的荧光曲线。如果用这个程序照 射叶片的话,用传统荧光仪记录的典型“ Kautsky-type”诱导曲线如图3.1B中 标注了"1eaf"的荧光曲线。从图3.1B中的荧光曲线中我们可以看到光化光的强 度大大影响了荧光信号的强度,当光化光强度较高时记录的荧光信号远高于当 光化光较低时记录的荧光信号。传统荧光仪不仅记录由测量光激发的荧光也记 录了由光化光激发的荧光,即传统荧光仪记录的是这两种荧光信号的加和
调制叶绿素荧光仪 Junior-PAM 操作手册 泽泉科技有限公司，德国 WALZ 公司中国技术服务中心 5 图3.1 调整荧光仪（PAM）测量图解 如果用图3.1 A的照光程序来照射Junior-PAM的荧光标准而用传统荧光仪进 行记录时就会得到图3.1 B中标注了"standard"的荧光曲线。如果用这个程序照 射叶片的话，用传统荧光仪记录的典型“Kautsky-type”诱导曲线如图3.1 B中 标注了"leaf"的荧光曲线。从图3.1 B中的荧光曲线中我们可以看到光化光的强 度大大影响了荧光信号的强度，当光化光强度较高时记录的荧光信号远高于当 光化光较低时记录的荧光信号。传统荧光仪不仅记录由测量光激发的荧光也记 录了由光化光激发的荧光，即传统荧光仪记录的是这两种荧光信号的加和
调制叶绿素荧光仪 Junior-PAN操作手册 泽泉科技有限公司,德国WALZ公司中国技术服务中心 而PAM荧光仪只记录由脉冲测量光激发的荧光(见图3.2B的插图)。因此, 用图3.1A的程序照射荧光标准时PM荧光仪记录的荧光信号是恒定的:而当照 射叶片时,虽然两个光化光光强相差一倍,但是PAM荧光仪记录的两个光化光下 的荧光曲线几乎是相同的(图3.1C)。 32饱和脉冲分析法 我们前面已经提到,叶片吸收的光能以热、荧光和光合作用的形式释放出 来,三条途径相互竞争。由于光合速率上升引起的荧光产量的淬灭称为光化学 淬灭,而其它部分的荧光淬灭都是由热耗散引起的,称之为非光化学淬灭。饱 和脉冲分析法可以区分光化学淬灭和非光化学淬灭 DARK ACTINIC LIGHT IFar Red Light [Far Red Light SPt 3000 画2000 1000 0 100 Times 200 300 8 open high high 图3.2饱和脉冲分析方法
调制叶绿素荧光仪 Junior-PAM 操作手册 泽泉科技有限公司，德国 WALZ 公司中国技术服务中心 6 而PAM荧光仪只记录由脉冲测量光激发的荧光（见图3.2 B的插图）。因此， 用图3.1 A的程序照射荧光标准时PAM荧光仪记录的荧光信号是恒定的；而当照 射叶片时，虽然两个光化光光强相差一倍，但是PAM荧光仪记录的两个光化光下 的荧光曲线几乎是相同的（图3.1 C）。 3.2 饱和脉冲分析法 我们前面已经提到，叶片吸收的光能以热、荧光和光合作用的形式释放出 来，三条途径相互竞争。由于光合速率上升引起的荧光产量的淬灭称为光化学 淬灭，而其它部分的荧光淬灭都是由热耗散引起的，称之为非光化学淬灭。饱 和脉冲分析法可以区分光化学淬灭和非光化学淬灭。 图3.2 饱和脉冲分析方法
调制叶绿素荧光仪 Junior-PAN操作手册 泽泉科技有限公司,德国WALZ公司中国技术服务中心 图3.2是一条荧光诱导曲线。当叶片在黑暗状态下长时间暗适应后所有的 PSII反应中心都处于开放状态,可以最大效率的将激发能转化成光化学。即,此 时的光化学淬灭是最大的。此时荧光产量最低,记作Fo。 暗适应叶片在照光前和照光后分别照射一个饱和脉冲光。“饱和”是指光 的强度和持续时间都足够完全还原两个光系统之间的电子载体从而使PSII缺乏 电子受体。在缺少电子受体的情况下,PSII的反应中心不能进行光化学反应从 而完全关闭,即,光化学淬灭为0。此时,荧光产量达到最大值记作Fm(暗适应 后样品)或Fm’(光下样品) 在图3.2中,每次饱和脉冲后照射了几秒钟的远红光。运红光被PSI吸收 (PSII吸收的很少)。PSI吸收远红光后迅速从电子传递链中获得电子从而使 PSI的反应中心打开使光化学淬灭最大化。照远红光使荧光产量降到一个很低 的水平,记作Fo 照射光化光时,会在类囊体膜两侧产生跨膜质子梯度(ΔPH)及叶黄素、玉 米黄质。跨膜质子梯度和玉米黄质的浓度可以很好的反映非光化学淬灭。当光 化光关闭后,跨膜质子梯度瓦解叶黄素逐步转化成堇菜黄质。 然而,远红光引起的PSII反应中心开放速度比跨膜质子梯度的瓦解和叶黄 素的转化要快。因此,当关闭光化光照射远红光时的最小荧光产量代表的是处 于开放状态的PSII反应中心存在非光化学淬灭时的荧光产量。关掉光化光后叶 片要暗适应一段时间才能使PSII的反应中心完全打开。 综上,饱和脉冲分析法提供的主要信息如下: (1)处于黑暗或照光状态的叶片在照射饱和脉冲时光化学淬灭降到0同时荧 光产量达到最大(分别记做Fm或Fm’)。 (2)处于黑暗或照光状态的叶片在照射饱和脉冲前的荧光产量分别记做 或Fs 通常情况下我们使用荧光比值而不是荧光产量的绝对值来反映PSII的状 态。 WinContro1-3的各荧光比值参数计算公式参考表6.1
调制叶绿素荧光仪 Junior-PAM 操作手册 泽泉科技有限公司，德国 WALZ 公司中国技术服务中心 7 图3.2是一条荧光诱导曲线。当叶片在黑暗状态下长时间暗适应后所有的 PSII反应中心都处于开放状态，可以最大效率的将激发能转化成光化学。即，此 时的光化学淬灭是最大的。此时荧光产量最低，记作Fo。 暗适应叶片在照光前和照光后分别照射一个饱和脉冲光。“饱和”是指光 的强度和持续时间都足够完全还原两个光系统之间的电子载体从而使PSII缺乏 电子受体。在缺少电子受体的情况下，PSII的反应中心不能进行光化学反应从 而完全关闭，即，光化学淬灭为0。此时，荧光产量达到最大值记作Fm（暗适应 后样品）或Fm'（光下样品）。 在图3.2中，每次饱和脉冲后照射了几秒钟的远红光。运红光被PSI吸收 （PSII吸收的很少）。PSI吸收远红光后迅速从电子传递链中获得电子从而使 PSII的反应中心打开使光化学淬灭最大化。照远红光使荧光产量降到一个很低 的水平，记作Fo'。 照射光化光时，会在类囊体膜两侧产生跨膜质子梯度（ΔPH）及叶黄素、玉 米黄质。跨膜质子梯度和玉米黄质的浓度可以很好的反映非光化学淬灭。当光 化光关闭后，跨膜质子梯度瓦解叶黄素逐步转化成堇菜黄质。 然而，远红光引起的PSII反应中心开放速度比跨膜质子梯度的瓦解和叶黄 素的转化要快。因此，当关闭光化光照射远红光时的最小荧光产量代表的是处 于开放状态的PSII反应中心存在非光化学淬灭时的荧光产量。关掉光化光后叶 片要暗适应一段时间才能使PSII的反应中心完全打开。 综上，饱和脉冲分析法提供的主要信息如下： （1）处于黑暗或照光状态的叶片在照射饱和脉冲时光化学淬灭降到0同时荧 光产量达到最大（分别记做Fm或Fm'）。 （2）处于黑暗或照光状态的叶片在照射饱和脉冲前的荧光产量分别记做Fo 或Fs。 通常情况下我们使用荧光比值而不是荧光产量的绝对值来反映PSII的状 态。WinControl-3的各荧光比值参数计算公式参考表6.1